• Santé - Western, Quantité, échantillon

extraction et dosage des protéines totales

Je voudrais savoir quelle quantité de protéine on peut s'attendre à obtenir après extraction à partir de neurones. 1µg/million de cellules 1mg/million de cellules.  [...] J'ai lu plusieurs thèse où, après culture cellulaire, il faisait une extraction sur un échantillon de 1 000 000 de cellules (c'est courant j'ai l'impression) puis un dosage pour savoir la bonne quantité à déposer sur des gels de western-blot.  [...]

[Biologie Moléculaire] Biochimie: méthode de Western Blot

En fait, doser les protéines avant un Western blot permet de déposer la même quantité de protéines dans chaque et pour chaque échantillon.  [...] Ainsi, si tu as deux échantillons identiques, mais que tu déposes deux quantités différentes de protéines, les deux bandes auront une intensité différente. Ce qui peut fausser les conclusions (genre. mon echantillon 1 a plus de protéines que le 2, donc le 2 produit plus efficacement).  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot "semi-quantitatif", pourquoi??

Elle serait quantitative si vous déposiez une gamme de concentration de la protéine que vous souhaitez quantifier. En général ce que l'on fait c'est que l'on utilise une protéine standard (l'actine) et on dilue les échantillons pour avoir la même quantité dans tous les puits.  [...] Il est possible en western blot d'observer des variations de quantité de protéines, mais il faut être prudent pour éviter les biais méthodologiques. par exemple quand j'en faisais, j'utilisais comme référence la quantification d'un de mes échantillons, le même tout au long de la manip, je déposais chaque échantillon en double avec 2 concentrations différentes (ce qui me permettait de vérifier la proportionnalité entre mes 2 dépôts.  [...]

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot

Pourriez m'expliquer comment on fait pour normaliser une quantité de protéines lorsqu'on réalise un western blot, je sais qu'il faut utiliser des protéines comme la béta tubuline mais techniquement on fait comment.  [...] Et bien tu utilises un anticorps dirigée contre ta protéine de normalisation comme l'actine, la tubuline, le GAPDH... pour révéler sur la même membrane où tu as révélé ta protéine d'interêt. Si tu as déposé la même quantité de protéine dans les puits, ta protéine contrôle va te permettre de le confirmer visuellement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins

Pour le western en question, as tu un protocole detaillé Car sur les sites que tu m'a envoyés, ils donnent des ref d articles, mais ces derniers sont succints, ils ne décrivent pas très bien ce qu ils ont fait. Le problème avec les AC, c est d'arriver a repoduire exactement un protocole qui marche, sinon, ils marcheront pour certains expérimentateurs et pas pour d'autres.  [...] un stock entre 2 et 10 est confortable. Tu peux diluer avec le même tampon qui a servi a l'extraction. D'ailleurs pour déposer en western, vu qu'il faut le même volume partout, il faut prélever une quantité d'échantillon et compléter tout le monde au meme volume avec ce tampon, c'est donc plus pratique d'en faire plus et de le conserver.  [...]

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot chez E.COLI

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot chez E.COLI.  [...] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot chez E.COLI.  [...]

[Biochimie] Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

L'immunoblot ou Western blot est une méthode qui permet la détection et l'identification de protéines spécifiques dans un échantillon biologique.  [...] Concernant la quantité de PCNA j'avoue que là aussi je ne sais pas. Nous savons juste par l'énoncé que c'est une protéine chez l'humain qui est ubiquitiné quand il y a un stress. Peut-être que ces cellules contiennent naturellement autant de PCNA...car je ne pense pas qu'ils en ait rajouté dans les cellules.  [...]

[Biologie Cellulaire] ultracentrifugation et cellules!

je voudrais réaliser des ultracentrifugations différentielles afin de déterminer la localisation d'une protéine spécifique qui m'intéresse. mais au lieu de le faire sur tissu, j'aimerais le faire à partir de culture de HEK. Auriez vous une idée du nombre de cellules dont j'ai besoin pour avoir au final une quantité de proteine suffisante pour faire des western.  [...] Tout dépend du compartiment cellulaire que tu veux isoler, de la représentation de ta protéine dans ce compartiment...Donc c'est par l'expérience que tu sauras quelle quantité de cellule te permet d'avoir une bande convenable en western. Pour commencer tu peux essayer plusieurs conditions où tu auras mis un nombre croissant de cellules.  [...]

Western Blot et coomassie

en fait on colore au bleu de coomassie toutes les protéines du gel. Si c'est une protéine purifiée, ou une protéine produite in vitro, ça peut suffire puisqu'elle sera largement majoritaire. Sur un lysat cellulaire par exemple c'est plus difficile puisqu'il y a des milliers de protéines différentes mélangées, et dans ce cas un bleu de coomassie n'apporte pas grand chose (a part pour avoir un profil, une mesure globale de quantité, etc.).  [...] Le western blot utilise pour révéler la protéine des anticorps spécifiques. On a donc deux (meme trois) informations. la taille, la quantité et la qualité. si vous détectez votre protéine vous êtes sur que c'est bien elle, pas d'usurpation possible. C'est une information de spécificité.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pull down GST

Si ta production n'est pas très grande, attention toutefois à la quantité de billes nécessaire, car plus il y a de billes, plus tu augmentes la possibilité d'intéractions aspécifiques avec les billes. Ta protéine est elle soluble Car il se peut aussi qu'elle soit produite en grande quantité, mais non solubilisée dans le tampon d'extraction.  [...] La quantité nécessaire dépend de plein de paramètres, dont le poids moléculaire de la protéine d'intérêt (plus son PM est petit, moins il y a en besoin, car plus il y a de mole/µg), la force d'intéraction avec le partenaire, du type de détection (western blot, autoradiographie).  [...]