• Santé - Vecteur, Code, Protéine

Pourquoi utiliser le vecteur pH6EX3 pour faire du clonage moléculaire?

Dans une séance de laboratoire, on a utilisé le vecteur pH6EX3 pour y insérer un gène qui code pour la protéine BIP, pour transférer tout ça dans des bactéries E.coli. Je me demandais pourquoi on a utilisé ce verteur et pas un autre.  [...] peut être parce que ce plasmide permet de tagger l'insert avec un 6His. En fait cela permet de produire une protéine de fusion constituée de la séquence codée par l'insert et du tag 6xHis, tag qui peut être utilisé ensuite pour de la purification sur colonnes style NiNta, pratique pour avoir un peptide pur (ou presque).  [...]

[Biotechnologie] ADN recombinant réplication dépend du cycle cellulaire ?

Le plasmide (vecteur) qui fait partie de l'ADN recombinant sera injecté dans le cytoplasme d'une bactérie comme e.coli et donc la réplication de l'ADN recombinant sera dépendant du cycle cellulaire ou non.  [...] En fait l' ADN recombinant qui est composé de plasmide qui est le vecteur et de l'ADN inséré ainsi que d'autre gène inséré dans ce vecteur comme le gène de résistance à l'ampicilline le gène marqueur lactZ qui code pour la protéine béta galactosidase et le polylinker qui s'insère dans le gène marqueur lactZ sans influencé son fonctionnement, bref en gros lors de l'injection de l'ADN recombinant dans les cellules hote comme e.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination transformation

Cas typique avec les transformants sur ampicilline. le gène de résistance à l'ampicilline qui est sur ton vecteur code une protéine qui peut diffuser dans le milieu et conférer une pseudo-résistance à des cellules qui n'ont pas ton plasmide, donc des faux-positifs.  [...] Et pour la coloration verte, peut-être que l'intégration a eu lieu dans un gène codant pour une protéine impliquée dans une voie du métabolisme. Si cette protéine n'est plus produite à cause de la recombinaison, elle ne peut plus faire son boulot et il y a peut-être accumulation d'un métabolite vert dans les bactéries (cette protéine est donc probablement non essentielle).  [...]

vecteur d'expression

Je ne suis pas sur de comprendre. Le vecteur d'expression est le gène qui code pour la protéine recombinante ou bien c'est un fragment d'ADN qu'on ajoute en plus pour amorcer la transcription.  [...] Il existe des cellules qui ont été modifié pour les rendre permissive pour SV40(ex. HEK293T)... mais si tu veux exprimer ton gène il faut les transfecter avec un vecteur contenant un promoteur SV40.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

j'essaye de resoudre un petit probleme dans lequel j'ai un ARNm qui code pour une proteine. Je dois choisir un vecteur pour pouvoir reproduire cette proteine dans une bacterie.  [...] Vous cherchez un vecteur qui va permettre d'exprimer votre protéine d'intérêt Sans même regarder la carte de restriction et s'y connaître même un minimum en biologie moléculaire, on peut lire ceci dans la première phrase des documents qui vous sont fournis pour chacun des vecteurs.  [...]

ubiquitine et protéasome

Je t explique la manip. Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation.  [...] Si tu mets un bloqueur il n'y aura pas dégradation. Si tu vois une accumulation avec ton vecteur et sans ton vecteur (toujours avec un bloqueur) c'est que ton vecteur ne joue pas de rôle dans la dégradation. Si tu veux voir l'ubiquitination de la protéine alor sil faut bloquer le protéasome, et tu peux utiliser la technique classique de purif (mais qui est pas évidente du tout et demande un paquet d emise au point).  [...]

Protéine de fusion recombinante dimérique, besoin d'aide.

C'est un vecteur d'expression pour la proinsuline et l'écotine. Et dans l'énoncé, il est noté que l'écotine est une protéine dimérique. Du coup, je pensais qu'il fallait faire deux plasmides. Un avec la proinsuline et l'écotine et un autre juste avec l'écotine.  [...] Si l'écotine se dimérise, il suffit de faire un seul vecteur avec un gène fusionnant écotine et proinsuline, et la dimérisation de cette protéine de fusion se fera spontanément via le domaine écotine.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

J'ai besoin d'aide pour une question dans un exercice portant sur la construction d'un vecteur d'expression pour une proteine recombinante.  [...] On me demande de présenter les caractéristique generales de ce type de vecteur pour permettre son amplification dans le colibacille puis l'expression de notre proteine recombinante dans les cellules de souris.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression hétérologue de protéine : vecteur baculoviral

Sinon moi y en a pas être microbiologiste mais il n'y a jamais de protéines avec des ponts disuflures dans les bactéries Elles ne produisent pas les enzymes J'ai un peu du mal à croire cela.  [...] Non, ce sont les DO que j'obtiens en 36h en milieu ZYP (auto-inducteur). Quand je fais avec du LB, j'iduis à DO environ 2 (50uM d'IPTG final) et je les arrête à environ 4-5 de DO (de toute manière, elle ne monte pas plus haut dans ces conditions). Le truc est que même dans ces conditions, je détecte la protéine en blot mais je ne la vois pas du tout en bleu de Coomassie.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

3. Pour mieux cerner ton problème, tu commences par répéter ton protocole de production en utilisant le vecteur vide au lieu de ta construction. La GST est une protéine très facile à produire donc tu en auras des tonnes si ton protocole est correct. Rend toi au 4 si tu as beaucoup de GST, sinon rend toi au 7.  [...] 7. Si tu n'arrives pas à produire la GST seule, c'est ton protocole de production qui a un problème. Essaie un autre protocole avec le vecteur vide d'abord puis une fois que ça marchera tu essaieras avec ta protéine de fusion.  [...]