• Santé - Vecteur, ADN, Plasmide

[Génétique] pb clonage moléculaire

Traitement de l'ADN linéarisé du plasmide vecteur avec la phosphatase alcaline qui enlève les groupes 5' phosphate terminaux évité la recirculation du vecteur et la formation de dimères de plasmide. Après ce traitement, on puisse donc ajouté l'insert.  [...] Les cellules de Ecoli et l'ADN plasmidique interagissent de façon productive en présence d'ions calcium et à base Température (o-5°C).  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

Elles permettent notamment en génie des vecteurs, d'ouvrir un plasmide, et d'y insérer un gène YFG dont les extrémités sont construites pour etre complémentaires avec le site de restriction pour que cela colle pile poil.  [...] On ne clone pas avec un plasmide mais dans un plasmide. Cloner, c'est le fait de reproduire à l'identique quelque chose. Un clone, c'est l'ensemble des éléments identiques (deux jumeaux forment un clone). Ainsi pour cloner de l'ADN, on l'insert dans un vecteur (dans votre cas un plasmide) et on amplifie la quantité de vecteur.  [...]

[Microbiologie] clonage

je dois cloner un fragment d'ADN dans un plasmide pbluescript, j'ai digéré le vecteur par ECO RI je dois effectué une déphosphorylation afin d'éviter la recircularisation de plasmide, comment je peux m'assurer que la déphosphorylation a été faite avec succès après l'avoir traité par la phosphatase alcaline.  [...]

Transformation/inativation d'un gène

Oui tu peux transformer par des vecteurs plasmidiques ta levure et la sélection soit sur antibio soit par marqueur d'auxotrophie.  [...] Dans ce cas tu dois transfecter de l'ADN linéaire, tu fais ta construction et tu linéarises. Si tu as créé une cassette dans ton vecteur bactérien tu purifie après linéarisation. Si tu veux utilisé tout le plasmide en entier je passerai sur gel quand même pour être certain que tu as que de l'ADN linéaire.  [...]

Carte de restriction d'un plasmide

bonjour tout le monde. s'il vous plait je vous savoir comment on peut déterminer la taille d'un vecteur et celle d'ADN génomique dans un plasmide recombinant, j'ai trop cherché sur l'internet mais j'ai pas trouvé la réponse précise. merci d'avance.  [...] AInsi je comprend pas du totu leurs placement, par exemple pourquoi Bam H1 ne se trouve t-il pas à 3700 pbde même pour EcoR1 qui ne se trouve pas comme indiqué à 3300 dans le plasmide.  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Lors d'une transformation transitoire, est ce que les histones se lient a l'ADN du vecteur pour former des nucléosomes ou la petite taille du plasmide empêche justement les nucléosomes de se former Observera-t'on une différence entre un plasmide eucaryote et un plasmide bactérien au niveau de ces nucléosomes.  [...] Tous les promoteurs eucaryotes ne sont pas identiques certains fonctionne chez d'autres espèces (en général ce sont des gènes issus d'organismes pathogènes) mais selon mon expérience la plupart du temps ça ne marche pas. C'est pourquoi on utilise des plasmide dit d'expression qui ont un promoteur et un terminateur plus ou moins fort en fonction de ce que tu veux faire voir même inductible, provenant en général de l'organisme hôte.  [...]

Transfection plasmide gateway et faible expression proteique

J'essaye en ce moment de transfecter un plasmide pDEST40 (construit avec technologie gateway) et j'obtiens une expression proteique vraiment très faible.  [...] Je veux transfecter des Hek293T, j'ai essayer différents kit d'extraction du plasmide, vérifié la sequence du vecteur et de ma protéine, verifié la concentration d'ADN, testé plusieurs concentrations... je ne sais pas quoi faire d'autre.  [...]

[Microbiologie] ligation clonage

En principe dans la formule de simple ligation (que tu peux trouver via google très facilement), tu tiens compte de la taille de l'insert, du plasmide et de leur quantité respectivement pour avoir le meilleur ratio insert/plasmide.  [...] merci pour votre coopération, juste j'aimerais bien savoir quand est ce que je peux utiliser les ratios 1.1, 1.5, et 1.3 (insert/vecteur) comment je peux savoir si les bouts sont cohésifs ou pas sachant que j'ai utilisé ECOR I pour traiter mon plasmide et l'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Nous avons fait une clonage d'un ADNc dans un plasmide... En parallèle, nous avons fait un contrôle négatif qui contenait le vecteur mais sans insert (l'insert étant remplacé par de l'eau distillée). J'aimerais savoir à quoi sert exactement le contrôle négatif.  [...] Pour l'instant, nous n'avons aucun moyen de contrôler que nos colonies aient bien pris le vecteur + l'insert. C'est un tp en plusieurs séances, le tp de lundi prochain a pour but de vérifier le clonage en purifiant les ADN plasmidiques puis on fera des digestions enzymatiques contrôles.  [...]

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

Une banque d'ADNc correspond aux clonages de tous les ADNc obtenus dans un vecteur. Cette banque est alors utilisée dans un crible afin d'identifier le clone possédant le(s) gene(s) recherché(s). Une fois les clones identifiés, il s'agit de preparer les plasmides et de les sequencer afin de caracteriser le fragment cloné.  [...] Quand on veut cribler une banque d'ADNc avec une sonde ADN marquée, il faut dénaturer avant le vecteur (le plasmide par exemple).  [...]