• Santé - Transformation, Bactérie, Plasmide

[Génétique] différence transgenèse et transformation plasmidique

Le fait d'insérer un gène dans un plasmide, ça s'appelle un clonage. La transformation c'est simplement l'entrée d'un plasmide dans une bactérie. La transfection est l'équivalent de la transformation mais chez les eucaryotes.  [...] Le transgène s'intègre dans le génome de l'hôte, il fait donc partie intégrante du patrimoine génétique de l'hôte. A l'inverse, après transformation d'une bactérie, il n'y a pas d'intégration du plasmide dans le génome de la bactérie. Donc si le plasmide n'a aucune utilité pour la bactérie, il ne perdurera pas et sera perdu, à la différence d'un transgène chez un eucaryote qui lui perdure forcément puisqu'il fait partie du génome.  [...]

[Biologie Moléculaire] Selection de bactéries par Antibiotiques lors du clonage d'ADN

Le vocabulaire que tu utilises n'est pas le bon. On ne parle pas d'incorporation mais de transformation (même si on comprend le sens). La bactérie est transformée par un plasmide. Plasmide intact. ça ne veut pas dire grand chose, là il faut parler de plasmide non recombiné.  [...] tu sélectionnes d'abord les transformants sur ampicilline, puis, à l'aide d'un tampon de velours, tu répliques les clones de la boîtes ampi sur une boîte contenant de la tétracycline. Ceux qui poussent ont le plasmide sans le gène d'intérêt. Ceux qui ne poussent pas ont le plasmide, mais leur gène TetR est inactivé et donc le gène est potentiellement inséré dedans.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Et je bloque à cette étape. j'obtiens autant de clones pour mes bactéries transformées par le vecteur linéarisé que par celles transformées par le plasmide natif. J'en ai donc déduit une mauvaise digestion. Or, j'utilise les enzymes Fast Digest de chez Fermentas pour une digestion o/n.  [...] Si tu fais une transformation avec 100ng de plasmide tu peux avoir beaucoup de transformants. Alors si tu peux 1micro gramme de plasmide que tu digères, s'il reste même moins de 10% de plasmide non digéré tu vas avoir des soucis lors de ta transfo.  [...]

[Génétique] Production d'interleukine 2

Et bien comme toute proétine recombinante produite chez des eucaryotes ils faut passer par un vecteur type plasmidique ou virale porteur de la séquence codante de l'IL2 afin de la produire. Afin d'en faciliter la purification tu peux la tager (ex. tag 6His ou autre).  [...] Il faudrait déjà que tu choisisses ton système de production (eucaryote me parait le mieux..), que tu choisisses ton vecteur (un plasmide me parait pas mal, avec un tag pour la purification), que tu trouves la séquence cDNA de l'IL2 (sequence CDS sur pubmed), que tu définisse ta stratégie de clonage (les bonnes enzymes de restriction en fonction de ton plasmide et de ton insert), tu fais une ligation, puis une transformation en bactérie.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

Ensuite il faut insérer tout les plasmides dans une bactérie lambda, effectuer une transformation bactérienne pour rendre la protéine native inefficace. Puis la bactérie portant le bon plasmide est sélectionnée parmi toutes les autres sur un milieu nécessitant la protéine d'intérêt (or le gène natif ayant été muté, la protéine ne pourra provenir que du plasmide).  [...] Pas nécessairement de l'ampicilline. Le choix du marqueur de sélection dépend du plasmide que vous utilisez. Le plus courant est que ce plasmide contient un gène de résistance à l'ampicilline. Quand vous transformez votre bactérie avec votre plasmide, ce dernier lui confère la résistance à l'ampicilline.  [...]

isolation d'un plasmide

S'assurer que la bactérie ne possède pas de plasmide avant la transformation Et bien en principe, elles ne possèdent pas le plasmide d'intéret (logique). Tout autre plasmide nous est indifférent. Ce que l'on fait en pratique, c'est que l'on verifie après coup que les bactéries que l'on a selectionnées portent bien l'insert d'intéret (digestion de restriction, séquencage).  [...] Les bactéries compétentes utilisées pour la transformation et l'amplification ne possédent pas de plasmides... pour t'en rendre compte, fait, à partir d'une colonie, une culture de bactéries non transformées d'une part et transformées d'autre part... fait ensuite une miniprep d'ADN plasmidique.  [...]

Intégration dans un plasmide

Savez vous comment s'effectue l'intégration d'un gène dans un plasmide bactérien (Le gène a déjà réussi a pénétré dans la bactérie grâce à la transformation).  [...] Non, c'est pas systematique. Ca depend de la qualité de tes digestions, de la taille de ton vecteur et de ton insert. Par contre, ce genre de construction se fait in vitro. Tu transformes ensuite la bacterie par ton plasmide. Pour integrer un fragment d'ADN dans un plasmide deja dans une cellule, je dirais que tu ne peux le faire que par recombinaison homologue, mais c'est bcp plus compliqué et j'ai jamais entendu d'une telle manip pour modiifier des plamisdes.  [...]

Compétence bactérienne

La compétence bactérienne est sa capacité à introduire de l'ADN étranger. Une bactérie compétente peut le faire. Une bactérie non compétente ne peut pas.  [...] Pour le taux de transformation, je pense que sur le test est réalisé sur plusieurs bactérie. Tu regardes sur ton maximum de bactéries combien ont intégré le plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

J'ai transformé des bactéries DH5alpha avec mon plasmide GST et mon plasmide GST-prot d'intérêt. Pour chaque transformation j'ai effectué un contrôle non induit. J'ai testé deux stragégies d'induction avec 1 mM IPTG. 2h à 37°C ou toute la nuit à 30°C.  [...] De la même manière j'ai co-migré un extrait protéique obtenu après transformation des bactéries avec un pGEX vide et là aussi la colonne reste entièrement vide. Ces contrôles signifient bien que mon anticorps ne marque pas une protéine bactérienne endogène ou un bidule provoqué par l'insertion du seul plasmide.  [...]

[Biochimie] Mutagénèse dirigée

A ne pas négliger, le fait que tu es choisi d'autres bactéries que celle du kit. Sont-elles compétentes pour une transformation par choc thermique Est-ce les mêmes que celles utilisées pour les clonages qui ont fonctionné précédemment.  [...] Le problème est probablement résolu depuis belle lurette, mais si quelqu'un est dans le même cas de figure, j'apporte tout de même mon grain de sel. Je pense que le problème est bel et bien que la transformation n'est pas fait dans la bonne bactérie. En effet, les plasmides issus de cette mutagénèse ne sont pas fermés, ils doivent donc être transformés dans des XL1 qui a la capacité de lier les deux bouts du plasmide.  [...]