• Santé - Tag, Protéine, Intérêt

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

PinPoint contient un promoteur tac de transcription suivi de la séquence d'un tag-Xa. Le tag est un petit peptide qui permet de purifier la protéine indépendamment de la protéine d'intérêt, il est suivi de Xa qui est une protéine qui peut être clivée et permet de donc de retirer le tag après purification pour n'avoir plus que la protéine native.  [...] On trouve derrière la cassette de clonage pour insérer votre protéine d'intérêt. C'est donc un vecteur de choix pour la production (il porte un promoteur de transcription) et la purification (un tag excisable) des protéines.  [...]

[Biologie Moléculaire] purif des proteines recombinantes apres coupure au facteur X

la carte de mon plasmide est comme suit. une Chaperonne située en 5' (appelée Trigger factor. cela facilite le bon repliement de ma proteine d'interet et augmente d'une facon tres significative la solubilité de la proteine recombinante) suivi d'un His-tag puis du site de coupure du Facteur Xa et à la fin le Multiple cloning site.  [...] du coup si tu coupes avec le facteur X tu libères 2 fractions. La Chaperonne avec l'His tag (52 Kd) et la proteine d'interet (25 Kd).  [...]

Méthode de marquage - HaloTag

Si j'ai bien compris la brochure, en gros au lieu d'avoir une GFP comme protéine de fusion, c'est le Halo tag qui est couplé à la protéine d'intérêt. Le principe a l'air assez simple, en gros on peut ensuite coupler n'importe quoi sur le Halo (billes, biotine, fluorophore.  [...] ..). Ce qui fait qu'on peut l'utiliser pour localiser la protéines d'intérêt dans un tissu ou une cellule avec la fluo, mais aussi coupler avec des billes pour faire un réaction biochimique, ou encore fixer la protéine sur une lame de verre, le tout sans devoir recommencer le clonage à chaque nouvelle application.  [...]

Technique pour intégrer une protéine chimère dans la membrane externe?

Je cherche à savoir s'il est possible, à partir de la séquence nucléotidique d'une protéine d'intérêt ( possédant les carractéristiques membranaire ), d'ajouter une séquence tag, lui permettant d'être intégrée à la membrane extracellulaire, et si oui, comment gérer son orientation d'intégration.  [...] Oui je pense que c'est possible. Il suffit de lui mettre une bonne séquence d'adressage en Nt. Pour l'orientation il me semble que ca va dépendre beaucoup du nombre de segment TM que possède ta protéine. Mais le mieux serait de lui mettre les signaux provenant d'une protéine qui à l'orientation que tu désires.  [...]

[Biologie Cellulaire] Manip de co-IP??? what's wrong!!!

Une dernière chose. si après avoir testé toutes les étapes tu t'aperçois que tu as toujours ta protéine d'intérêt, il est possible que l'anticorps anti-tag reconnaisse la protéine endogène i.e. celle qui n'est pas taguée. Cela est très rare mais ça m'est déjà arrivé.  [...] j'immunoprécipite et là je révèle la topo2 dans tous les culots d'IP même dans les cellules non transfectées V5 (je rappelle que l'Ac immunopricipitant et l'anti V5 qui tague ma protéine d'interêt). je suis resté bouche B, et je suis rentré chez moi pour dormir.  [...]

Levures et TAP tag à grande échelle

La technique du TAP-tag permet bien de purifier des complexes entiers. On utilise une protéine fusionnée au tag comme appat, et au bout de deux purifications (colonne d'IgG et colonne de calmoduline), on considère que les protéines co-purifiées interagissent de manière assez spécifique avec la protéine d'intérêt pour qu'elles forment réellement un complexe.  [...] La technique est utile pour émettre des hypothèses sur la fonction d'une protéine inconnue. en trouvant dans un même complexe des protéines de fonction connue, on peut avoir une idée de la fonction de la protéine d'intérêt.  [...]

[Immunologie] Fixation pour immonofluorescence

Par contre ils restent visibles dans les cellules transfectées avec les plasmides contenant mes gènes d'intérets. J'ai peur que les méthodes de fixations utilisées n'entrainent une relocalisation cellulaire de mes protéines.  [...] Le plasmide vide signifie qu'il n'y a que la GFP. Donc la GFP est exprimée seule, pas en fusion avec la protéine d'intérêt. Cela fournit un contrôle indispensable pour montrer que les conditions utilisées n'affecte pas la localisation de la GFP, et donc prouver qu'une relocalisation éventuelle de la protéine de fusion GFP-X est spécifique de la protéine X.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteur pET15b et 19b

Je suis entrain de tenter de sur-exprimer des protéines chez les cellules BL21 DE3 et malheuresement ça ne surexprime pas... Le vecteur utilisé est le pET19b et en parcourant un peu la biblio je suis tombé sur un article où pour la surexpression de la même protéine le vecteur pET 15b a été utilisé.  [...] C'est possible mais ce qui me semble plus probable, c'est que tu as de la protéolyse spontanée entre le tag et ta protéine d'intérêt dans un seul des deux cas. Ta protéine est présente dans le lysat cellulaire ou non.  [...]

[Biologie Moléculaire] rrnB plasmide pMALc2x

Petite question de biologie moléculaire, j'ai ajouté mon gène d'intérêt dans le vecteur pMALc2x afin de produire ma protéine avec le tag MBP. Le promoteur est le promoteur tac inducible par IPTG pas de problème, mais à quoi correspondent les régions rrnB ce serait des terminateurs, mais pourquoi je ne les ai jamais vu sur les autres vecteurs d'expression type pET par exemple et surtout qu'est ce que cela apporte de plus, pourquoi avoir choisit un terminateur qui se compose de 2 régions.  [...]

[Biochimie] Dégradation tag et protéase

Que voulez faire exactement Si c'est pour éliminer le tag, plusieurs options existent déjà telles qu'intercaller un site de coupure pour une enzyme spécifique entre le tag et la protéine d'intérêt.  [...] Donc connaissez vous un autre couple degradation tag /protease d'un organisme donneur qui n'interfère pas avec les protéines d'un organisme receveur.  [...]