• Santé - Synthèse, Marquage, ARN

[Biochimie] problèmes avec ARN long et structuré

Je viens de commencer en thèse et j'ai besoin de conseils relatifs à la synthèse et au marquage radioactif d'un ARN. Je suis confrontée à deux types de problèmes. le premier, j'ai un très faible rendement lorsque je transcrit cet ARN (0,6 ou 0,8µl/µg max).  [...] Là vient mon second problème. une fois transcrit, je procède à une déphosphorylation avant de marquer mon ARN radioactivement. En faisant un gel controle apres déphosphorylation, j'observe que ma bande ARN est relativement propre mais une fois l'ARN marqué et les premieres manips (EMSA) effectuées, je n'obtiens aucun résultat et je me rends compte que mon ARN est tres dégradé.  [...]

[Génétique] Découverte du sens de transcription 5' vers 3'

D'après l'explication de mon prof, les scientifiques qui ont trouvé ça ont utilisé des dNTP radio-marqué. De l' ATP (ou GTP) marqué au 32P sur le phosphate alpha et de l'ATP (ou GTP) marqué au 32P sur le phosphate gamma. Le marquage en alpha servant à mesuré une activité globale des brins synthétisé par l'ARNpol (le P alpha étant incorporé au brin d'ARN) alors que le marquage en gamma sert à visualiser le nombre de transcrit (seul le P gamma du premier nucléotide est conservé au cours de la transcription).  [...] . Incubation du milieu de transcription avec ATP gamma 32P pendant un temps court puis addition ATP non marqué en grande quantité. Analyse du produit synthétisé pour définir l'endroit où est incorporé le 32P.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transcriptomiques : micro-arrays

Je suis en M2 et j'ai eu un cours sur l'étude du transcriptome. Nous avons alors étudié les puces Affymetrix, et après relecture de mon cours, je n'ai pas comprit le principe de la photolithographie...si ce n'est que les oligos sont donc synthétisés in situ, qu'il y a 11 oligos perfect match et 11 oligos mismatch, que l'on fait un marquage à la biotine et que c'est l'ARN qui est marqué.  [...] La manière dont tu fabriques les puces n'a que peu d'importance sauf si tu t'y intéresse vraiment, auquel cas je pourrai pas vraiment t'aider. Mais globalement pour la fabrication des puces, soit tu synthétise à part ton oligo et tu le fixe après à la puce, soit tu synthétise directement l'oligo sur la puce en ajoutant petit à petit les nucléotides, entre chaque phase d'ajout ils mettent des couches d'un matériau pour bien laver, et ils l'enlèvent pour avant d'ajouter le nucléotide suivant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Synthese de novo

Etudiante en biologie, j'aimerais savoir si quelqu'un pourrait m'expliquer ce qu'est précisément la synthese de novo de l'ADN. Je pense qu'il s'agit de la synthese de sondes nucléiques. Je sais aussi qu'il y a d'autres types de synthèse comme la synthèse par deplacement de coupure ou par marquage terminal.  [...] La synthése d'ADN de novo c'est donc peut-être la nouvelle synthése d'ADN par exemple quand une cellule se divise elle synthétise de nouveau brin d'ADN soit synthése des novo.  [...]

[Biologie Moléculaire] Marquage d'une sonde

lors du random Priming (ou marquage par multi amorçage), est-ce que les brins synthétisés par la polymérase à partir des amorces vont se lier à la fin par une ligase, ou bien l'ARN polymérase va-t-elle hydrolyser les amorce ce qui va coller tous les brins, ou bien les brins restent séparés.  [...] Si les brins restent séparés, comment ça se fait que la polymérase ne les collent pas De plus, si les brins sont séparés lors de ce marquage de la sonde, on peut utiliser n'importe quel brin pour marquer le gène pour lequel on a fait la sonde, ou bien faut utiliser tous les brins pour que ça puisse reconnaître le brin d'ADN qu'on veut.  [...]

mitoses marquées ?

Je voudrais savoir si vous avez des infos sur ce qu'est la mitose marquée et en quoi elle peut nous aider à expliquer le veillissement cellulaire (senescence)... pour l'instant j'ai recherché sur google mais je ne trouve rien (juste 10 résultats en gros et ils n'expliquent pas).  [...] La mitose marqué je ne connais pas mais en réfléchissant un peu ce doit être un marquage par des acides nucléiques radioactif, en correspondance avec la mort cellulaire programée (apoptose), ce marquage doit permettre de suivre les gènes impliqué dans ce phénomène (apoptose), en particulier la transcription des ARN permettant cette mort.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème de reconnaissance de photos

J'ai également l'impression qu'on visualise de l'ARN... Dans ce cas-là, à quelle étape particulière on pourrait s'intéresser à part la transcription Si on fait un marquage en pulse on voit d'abord une certaine quantité d'ARN uniquement dans le noyau (cliché B) puis ces ARN sont dilués (cliché A) par transport vers le cytoplasme pour une éventuelle traduction (si ce sont des ARNm).  [...] Merci pour les précisions. J'avais aussi pensé à un marquage en pulse mais je bloquais sur les ARN marqués déjà sortis du noyau en A, alors qu'en B finalement on n'en voit pas beaucoup en dehors du noyau. On ne doit pas y faire attention.  [...]

[Biologie Moléculaire] Kit de purification ARN Qiagen

[Biologie Moléculaire] Kit de purification ARN Qiagen.  [...] J'aurais aimé faire appel à vos expériences sur les kit de purification Qiagen. J'utilise le Mini kit pour purifier des ARN marqué avec de la cyanine (marquage Agilent). J'aurais souhaitais savoir si vous aviez déjà rencontré des problèmes avec les colonnes, perte de la totalité des ARN à purifier par exemple mais tout autres problèmes seraient les bien venus.  [...]

Hybridation in situ

Donc si je comprend bien le principe, l'ADN de saumon se fixe sur l'ADN et l'ARN du tissu sur lequel je veux faire l'hybridation in situ, et quand je dépose la ribosonde spécique il y a une compétition entre l'ADN de saumon fixé et la sonde, diminuant ainsi le marquage aspécifique tandisque ma sonde se fixe sur l'ARN que l'on veut mettre en évidence.  [...] Donc tu déplace le bruit de fond vers l'ADN de saumon. Et comme tu vas éliminer cet ADN tu diminues le bruit de fond de ta préparation. L'interet de l'ADN de saumon est de diminuer le signal nucléaire de tes préparation (hybridation ADN/ARN). Ca reste très théorique et dans la pratique je ne le fais pas.  [...]

[Biologie Cellulaire] marquage au BrdU

je ne comprends pas vraiment le principe du marquage au BrdU de l'ADN. je sais que ce marqueur remplace la thymine pendant la synthèse de l'ADN. du coup peut on le considérer comme un uracile.  [...] Ca a été montré en faisant des brefs pulses de BrdU à différents temps, et en regardant plus tard par immuno quelles couches du cortex étaient marquées.  [...]