• Santé - Sonde, ADN, Membrane

[Biochimie] Question sur la biotechnologie

Une méthode simple de criblage est l'hybridation sur membrane avec une sonde radioactive. Par exemple, si tu as réalisé ta banque par clonage avec des plasmides chez E. coli, tu fais une réplique des boîtes de Petri contenant la banque sur une membrane de nitrocellulose, tu soumets la membrane à l'action de la soude (qui lyse les bactéries et dénature l'ADN), ensuite tu incube la membrane avec une sonde radioactive complémentaire de ta séquence d'intérêt, puis tu révèles par autoradiographie.  [...] Dans une banque tu as de nombreux clones différents. Ceux identiques sont ceux qui forment une colonie (=un clone) sur ta boîte (car il faut des millions de bactéries pour former quelque chose de visible à l'oeil nu). Sur une boîte de Petri tu peux avoir des centaines de colonies qui correspondent à un fragment d'ADN unique au sein de la banque.  [...]

Sos....rflp

je voudrais avoir des informations concernants les RFLP, c'est qu'on a fait un cours dessus et j'ai pas bien pigé.. j'ai cru comprendre que c'est des marqueurs génétiques pour détécter les mutations à l'origine des maladies,ils sont obtenus par Southern Blot ou PCR en cas de microsatellites..et la notion du PIC.   [...] Sandwich. L'ADN cible est fixé sur une membrane de nitrocellulose puis hybridé avec une sonde.  [...]

dot blot- southern blot

Le southern est une technique de mise en évidence d'une séquence d'ADN. Il suffit de faire migrer l'ADN sur gel d'agarose, ensuite on fait une migration sur membrane, puis une révélation avec une sonde marqué.  [...] Cette technique a été mis au point par monsieur Southern, par la suite, pour la recherche des ARN et des protéines, le northern et southern ont été mis au point, et le nom est donc une blague par rapport au nom de Southern.   [...]

[Biologie Moléculaire] Réalisation d'un Southern Blot

Le SDS joue entre autres le role d'un agent mouillant qui va permettre aux differents constituants du tampon (de préhybridation, d'hybridation) d'atteindre la membrane. Dans un Southern blot l'hybridation entre la cible et la sonde n'est pas libre comme dans une solution car l'ADN cible est fixée à la membrane de nylon et il y a une interaction complexe à l'interface entre une membrane solide et un liquide.  [...] Pour imager un peu, le SDS est un savon, et on lave mieux avec du savon que sans. et comme le nylon chargé positivement des membranes n'est pas forcement très hydrophyle, il permet aussi de mieux réaliser l'interface entre ADN/Membrane et la solution.  [...]

[Biologie Moléculaire] probleme avec ma PCR

Je dispose d'ADN dans lequel je dois amplifier un gene particulier. Disons A. Apres plusieurs PCR je n'ai aucun resultat. Alors que quand je transfert cet ADN sur membrane et que je fais une hybridation, j'ai des signaux. Ma sonde est le gene que je cherche mais amplifie avec un control positif.  [...] Ba si y en a pas assez tu peux avoir une amplification mais tu le vera pas sur le gel. En plus si c'est de l'ADN génomique, ta concentration est élevé mais ton nombre de copie beaucoup moindre. Et inversement, petit fragment avec concentration identique, sa fait beaucoup de copies... Tu est à combien en MgCl2.  [...]

[Biotechnologie] Technique de screening

On a à la base une librairie de phage contenant différents morceaux d'ADN. On est intéressé par l'un de ces fragments, dont on connait une partie de la séquence. Donc on réparti tout ça sur un gazon bactérien et on incube. Les phages qui ont infecté des bactéries vont créer des plaques.  [...] Après incubation, on place une membrane en nitrocellulose sur le dessus, en marquant son orientation et ensuite on va essayer de détecter les phages avec des sonde ADN radio-marquées (dirigées contre la séquence d'intérêt). Ainsi, on sait où se trouve notre phage dans notre gazon bactérien et on peut le prélever.  [...]

[Biologie Moléculaire] Southern blot !!!

On veut donc que ce soit l'ADN de sperme de saumon, et non notre sonde, qui se fixe non spécifiquement à notre membrane, d'où cet ajout en quantité saturante.  [...] C'est pour cela qu' avant de mettre les sondes en contact avec la membrane, on met la membrane en contact avec de l'ADN de saumon qui la recouvre entièrement.  [...]

[Biologie Moléculaire] marquage à la digoxigènine

mon pb se situe au niveau de l'hybridation de ma sonde avec de l'adn fixé sur une membrane.  [...] JE cherche à savoir la composition du tampon d'hybridation. Sur le site de roche il me conseil d'utiliser le leur ce qui est commercialement normal et il me donne 3 compositions différentes.   [...]

[Biologie Moléculaire] technique d'hybridation moléculaire

j'ai réalisé une hybridation moléculaire avec des sonde 16S et des sonde spécifiques d'un gène avec les fragments d'ADN d'une souche bactérienne.Le profil d'hybridation avec la sonde spécifique du gène m'a donné une seule bande de taille 2 megabases. Mon prof ma dit qu'elle correspond à un mini-chromosome.  [...] Pour hybrider des sondes, il a fallu que tu mette un produit pour perforer les membranes afin de laisser passer ta sonde non Si tel est le cas, peut être que cette étape n'a pas fonctionné et que ta sonde à hybridé un bout d'ADN d'une bactérie lysée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sperme de saumon

C'est bien la raison pour laquelle les acides nucléiques cibles se fixent sur la membrane (northern ou southern), on peut donc consevoir que de la même manière la sonde peut aussi se fixer sur la membrane, et pas uniquement sur les acides nucléiques complémentaires.  [...] Saturer les sites libres de la membrane empechent donc la fixation aspécifique de la sonde, et donc un bruit de fond trop important.  [...]