• Santé - Site, Restriction, ADN, Produit

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

L'amplification par PCR va donner des amplicons non méthylés (et aussi ne contenant plus ta cassette vu que l'amplification du vecteur exclura la cassette). Tu ajoutes à ton produit de PCR l'enzyme DpnI qui va cliver l'ADN méthylé en fragments de quelques centaines de bases (enzyme de restriction reconnaissant un site de 4 bases méthylé).  [...] Ainsi, seul ton vecteur d'origine (celui contenant ta cassette) sera digéré par cette enzyme, et pas ton produit de PCR, ce qui te permet de bien te débarrasser de ta cassette.Cela pourrait être une stratégie de rechange par rapport à ta stratégie actuelle qui est de simplement extraire la cassette avec des enzymes de restriction correspondant à ton futur site d'insertion.  [...]

[Biologie Moléculaire] enzymes de restriction

Lorsqu'une enzyme de restriction a efficacement digéré un ADN, cet ADN est coupé en un ou plusieurs sites. Comment vérifier qu'un ADN est coupé Cette technique fonctionne-t-elle quelque soit mon type d'ADN (génomique, plasmidique, produit de PCR, etc.).  [...] Ceci dit, cela ne fonctionne pas dans tous les cas, par exemple si la taille de la molécule après digestion est très proche de celle avant digestion (cas des sites de restrictions aux extrémités d'un produit de PCR).  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr

Voilà, je n'ai pas compris la correction d'un TD à propos de la PCR. Par le fait que l'on utilise des amorces oligonucléotidiques de synthèse, il est possible d'ajouter des séquences dans la région 5' de chaque amorce. Par exemple, un site de restriction aux 2 extrémités du fragment d'ADN synthétisé permettrons ultérieurement d'assembler le produit PCR dans un plasmide.  [...] Au cycle suivant, l'amorce (antisens cette fois) va s'hybrider sur ce nouveau brin, complémentaire et antiparallèle du brin matrice. L'élongation permettra de produire un brin complémentaire a ce nouveau brin, jusqu'a son extrêmité 3' qui contient le site de restriction.  [...]

[Biochimie] Analyse résultats PCR - TPE

3. La mutation génère/détruit un site de restriction. Vous le voyez en procédant à une digestion de restriction effectuée sur un produit PCR bornant le site de mutation.  [...] 4. L'extrémité 3' d'une amorce doit absolument être complémentaire du fragment à amplifier faute de quoi l'ADN polymérase ne peut pas amorce la réplication. Vous ciblez pile l'extrémité 3' de votre amorce sur le site muté. La PCR ne fonctionne pas contrairement à la population générale.  [...]

exercice de génomique assez complexe..

Soit une séquence d'ADN (bicaténaire) constituée de TCTAGA, site de restriction reconnu par l' endonucléase de restriction XbaI.  [...] Quels seraient les sites de clonage susceptible d'insérer cette séquence d'ADN, parmi les site de clonages suivants, qu'on supposera présents chez un vecteur quelconque.  [...]

[Biologie Moléculaire] Questions relatives à la PCR

Les séquences Alu sont des fragments d'ADN d'environ 300 pb qui sont mobiles dans le génome humain. On y retrouve un site de restriction Alul (d'où leur nom). Certaines personnes possèdent la séquence Alu. d'autres non. L'expérience en question impliquait que plusieurs personnes effectuaient un rincage de leur bouche (pour aller recueillir de l'ADN) avec de l'eau saline et crachait dans un tube qui était ensuite centrifuger.  [...] Les séquences Alu sont des fragments d'ADN d'environ 300 pb qui sont mobiles dans le génome humain. On y retrouve un site de restriction Alul (d'où leur nom). Certaines personnes possèdent la séquence Alu. d'autres non.  [...]

Clonage par PCR

J'ai une petite question... j'aimerais savoir a quoi correspond exactement l'expression clonage par PCR. Est-ce quand on ajoute en 5' de l'amorce la sequence specifique d'un site de restriction, ce qui permet ensuite de liger le produit de pcr dans un vecteur contenant le meme site de restriction (en resume) Ou bien est-ce autre chose.  [...] Je pense qu'il s'agit tout simplement d'un clonage à partir d'ADN que tu as amplifié par PCR q'il s'agisse d'une ligation après digestion enzymatique ou autre.  [...]

[Biologie Moléculaire] Site de restriction

Une coupure de l'ADN peut être engendré soit mécaniquement ou par des agents chimiques mais dans ce cas là on coupera l'ADN de façon aléatoire on ne pourra pas prédire l'endroit où ça va se casser tandis qu'avec une enzyme de restriction on coupe l'ADN à l'endroit où sera son site de restriction.  [...] Selon moi, la chose relève plutôt de l'endroit où se produit la coupure, pas des agents. Surtout, je ne vois pas comment un site de restriction sera présent sans que le site de coupure y soit (mutation ponctuelle exclue).  [...]

TP biochimie: introduction aux méthodes utilisées en génie génétique

Si tu veux introduire un plasmide en entier ou un voire des gènes dans une bactérie il y aurait la conjugaison où l'on a une bactérie donnatrice qui va donner le plasmide à une bactérie réceptrice par conjugaison. Pour que la donnatrice puisse donner son plasmide il faut que celui-ci possède les gènes tra indispensable pour la conjugaison car ils codent pour la formation des pili permettant le contact entre les 2 bactéries mais aussi le transfert de l'adn de la donnatrice vers la réceptrice.  [...] ok alors sur tes 3 plasmides tu as un ou plusieurs sites de restriction à EcoRI c'est un site que va reconnaître ton enzyme EcoRI et va donc couper ton ADN plasmidique à cette endroit précisément. Tu connais la taille de tes plasmides en pb et tu sais sur quel pb se situe le site de restriction.  [...]

électrophorèse sur gel d'agarose

Ta première enzyme ouvre le plasmide en coupant à un premier endroit. La seconde coupe à un autre site, et produit 2 morceaux de tailles différentes. d'où les 2 bandes.  [...] Pour le BET c'est bien le cas, je suppose que c'est pareil pour les autres intercalants de l'ADN. Par contre cette relation marche t'elle que pour les fragments linéaires Une bande correspondant a un plasmide surenroulé ne devrait-elle pas être moins intense du au fait que certaines bases de l'ADN soit inaccessible du a la topologie de l'ADN ou alors est-ce négligeable.  [...]