• Santé - Sélection, Cellules, Vecteur

[Biotechnologie] RNA interference : siRNA, shRNA

En culture cellulaire, si le vecteur est un plasmide, il ne s'intègre pas dans le génome mais peut se répliquer. Cependant il risque d'être expulser si il n'y as pas de pression de sélection comme une résistance à un antibiotique. Le moyen le plus sure de faire une lignée stable est d'utiliser un vecteur lentivirus, qui intègre la séquence du shRNA (ou de n'importe quel gène) dans le génome.  [...] En effet le shRNA a besoin d'un promoteur et d'autres séquences pour s'exprimer (moins ready to use que le si). On peut effectivement l'intégrer dans un vecteur adénoviral (qui ne s'intègre pas. effet transitoire) ou lentiviral (qui s'intègre, donc effet stable si on utilise une sélection des cellules ayant intégré le vecteur) ou AAV.  [...]

[Génétique] Démonstration du role d'un miRNA in-vivo

.. mais quant à démontrer formellement une fonction ca reste tres flou, et nettement pas vraiment spécialiste des miRNA je nage dans l'abondante bibliographie.   [...] Justement, par mutagenèse dirigée, avec la même procédure utilisée pour réaliser des souris KO à partir de cellules ES. Vecteur possédant la séquence à insérer avec partie flanquantes homologues à la partie amont/aval du site de recombinaison, et suivant la séquence mutée un gène codant une résistance pour faciliter la sélection des recombinants (Neomycine utilisée la plupart du temps).  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide génie génétique

Un plasmide artificiel (vecteur) porte un ou plusieurs gènes de résistances pour sélectionner des cellules qui dans lequel ce plasmide est introduit. Le gène lacZ permet soit d'identifier facilement les cellules portant un vecteur avec un insert de celles dont le vecteur est vide (criblage bleu/blanc comme pour le vecteur pUC18).  [...] Le gène LacZ est souvent présent dans le plasmide pour sélectionner les plasmides contenant un insert. Dans ces cas là, le polylinker est présent dans le gène LacZ. L'intégration d'un insert au niveau du polylinker a donc pour effet d'invalider la beta-galactosidase.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- controle positif. vecteur seul =. développement des cellules sur milieu sélectif, car le gene de sélection est contenu dans le vecteur qui est contenu dans les cellules.  [...] - controle négatif. pas d'ADN =. pas de développement des cellules sur milieu sélectif, car le gene de sélection n'est pas présent dans les cellules.  [...]

rats KO

Enfin certes la recombinaison homologue est théoriquement possible chez tous les mammifères mais à condition que l'on puisse maintenir les cellules ES de l'espece en culture, ce qui n'est pas le cas chez le rat il me semble...(car on transfecte les cellules ES par un vecteur contenant le marqueur, on selectionne les cellules ES ayant intégré le vecteur et on les réinjecte dans un blastocyte que l'on implante chez une mère porteuse).  [...] Non pas forcément. Un transgène est un fragment d'ADN que tu insères dans une cellule mais l'ADN en question peut très bien être la copie d'un gène endogène à l'espèce transfectée.  [...]

Thérapie génique : un espoir contre la bêta-thalassémie

On fait de l'addition de gène, pour remplacer celui qui fait défaut, grâce à une sorte de cheval de Troie qui va amener l' ADN thérapeutique, indique le Pr Leboulch. Pour les patients thalassémiques atteints de la forme grave et sans donneur de moelle compatible, avec des organes encore en bon état, on prélève des cellules souches du sang, on les mélange avec le vecteur, on congèle et on vérifie que le gène est bien rentré dans l'ADN.  [...] On décongèle et on place ces patients sous perfusion pour réinjecter ces cellules souches modifiées, ajoute-t-il. Le vecteur, appelé LentiGlobin, qui véhicule le gène-médicament, est fabriqué par bluebird bio.  [...]

Stratégies d'insertion de fusions de gènes

pour repondre a ta question, je ne vois pas pourquoi tu parles de disruption, puisque l'on peut tres bien faire de l'integration ciblée sans disrupter un gene ou sans en alterer son fonctionnement. In fois l'insertion effectuée, celle-ci est stable il n'y a donc pas besoin de maintenir la pression de selection.  [...] Pour que l'insertion soit stable, comment tu fais si tu ne maintiens pas la pression de sélection notamment dans le cas d'insertion via des transposases J'arrive à comprendre qu'une insertion via un plasmide vecteur et recombinaison homologue reste stable, mais le propre de l'élément transposable n'est-il pas justement de transposer La cellule a t-elle intérêt à maintenir une insertion qui ne lui apporte rien (c'est un peu finaliste comme question, mais c'est vrai.  [...]

[Journal club] Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

au sein d'un tissu embryonnaire, la probabilité de trouver des progéniteurs (je ne parle pas de cellules souches) est plus importante que dans le même tissu adulte, on est d'accord Une lignée cellulaire étant plus ou moins hétérogène, dans la lignée HEK on a donc beaucoup de chance d'avoir affaire à un nombre non négligeable de progéniteurs rénaux au sein de la population cellulaire.  [...] A priori si on séléctionne uniquement l'intégration et que l'on construit la lignée sur les cellules séléctionnées il y aura plusieurs sites d'intégration. La lignée est hétérogène. Si l'on fait une transformation controle avec un plasmide vide ou contenant un élément neutre, on devrait pouvoir discriminer les effets inserts dépendants des effets vecteur dépendants.  [...]

Thérapie génique : les raisons d'un échec

Le protocole de thérapie génétique consistait à insérer un gène fonctionnel aléatoirement dans les chromosomes des cellules précurseurs des lymphocytes T ex-vivo puis de réinjecter ces cellules modifiées chez l'enfant. L'insertion du gène fonctionnel codant pour un récepteur de l' interleukine 2 s'effectue grâce à un vecteur dérivé d'un rétrovirus.  [...] 3. Réduire la quantité de cellules exposées au vecteur pour l'intégration, puis réinjectées chez le malade. Ainsi en diminuant la quantité de cellules souches manipulées, et en caractérisant le site d'insertion du vecteur avant ré-injection, la sécurité des malades devrait être grandement améliorée.  [...]

[Biologie Moléculaire] e coli DH5

Salut a vous j'ai essayer de trouver un peu d'info sur e coli dh5a et tout ce que je trouve est en anglais. Je me demande qu'est-ce que cette souche a de particulier et pourquoi elle est tant utilisée.   [...] c'est une souche courament utilisée car elle possède tous les caractères à un clonage de base. sensibilité à l'ampicilline (sélection du vecteur ayant servit à la transfo), utilisation du gène lacZ (sélection de l'insert).  [...]