• Santé - Révélation, Protéine, Intérêt

[Biochimie] bandes parasites aprés révélation western-blot

j'aimerais savoir si quelqu'un à l'habitude de réaliser des immunoprécipitations avec révélation de la protéine d'intérêt en western blot.  [...] apré révélation du blot à l'opti 4CN (biorad) je retrouve bien ma protéine d'intérêt (IP fonctionne) ainsi que la bande haute et basse de mon Ac spécifique de ma protéine, mais si je laisse le blot révélé plus longtemps, je vois apparaitre d'autres bandes autour de celles de l'Ac (révélation du blot ~2min) ces bandes sont elles dû à un mauvais blocage de la membrane utilisation d'un Ac-HRP polyclonal comme Ac secondaire.  [...]

[Biologie Cellulaire] Anticorp anti-espece et Western Blot

Dans le western blotting, tu vas effectivement utiliser deux anticorps distincts. L'anticorps dit primaire (que tu as nommé AC1), et l'anticorps qui sera dirigé contre la protéine que tu souhaite mettre en evidence par le western blotting. Cetr anticorps aura été produit par immunisation d'un animal en utilisant la protéine d'intérêt comme antigène.  [...] L'anticorps secondaire (que tu as nommé AC2) est celui qui va te permettre de mettre en évidence la réaction AC1-protéine d'intérêt. cet anticorps (AC2) sera couplé à une molécule qui permettra la révélation (en général l'enzyme HRP, peroxydase de raifort).  [...]

[Biochimie] Problème avec mon western

J'ai un souci avec mon western blot sur SDS-Page, la migration et le transfert se sont bien déroulés, la première révélation de ma protéine d'intérêt s'était nickel.  [...] un pour la protéine d'intérêt, un pour le témoin de dépôt (actine dans ton cas). Bien entendu, cela n'est pas optimal pour la normalisation par le témoin de dépôt, mais si le dépôt est bien homogène entre les deux gels et que le volume est déposé avec précision, c'est valable.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western Blot ATM phosphorylé

A la révélation, je n'ai aucune bande ou au contraire quelque fois j'ai des bandes intéressantes mais qui ne correspondent pas à la taille de la protéine (250kDa). (L'anticorps utilisé est celui qui est le plus abondant dans les publications).  [...] Il faut aussi être sur que la protéine rentre dans le gel au moment de la migration, tu devrais essayer si ce n'est pas déjà fait un gel moins concentré (genre 7% mais c'est de la vraie morve).  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot avec membrane PVDF

Cependant après révélation, je retrouve sur toutes mes membranes le même genre de motifs, des bandes très épaisses entre 60 et 80 kDa par exemple. A cause de ça je n'arrive pas a détecter la présence de mes protéines d'intérêt, les bandes étant noyées dans les plus épaisses.  [...] J'ai déjà entendu dire que la membrane de PVDF pouvait mieux retenir certaines proteines, est- ce le cas Avez-vous déjà rencontré ce problème et si oui, comment peut-on éviter au mieux d'avoir un signal aspécifique.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot "semi-quantitatif", pourquoi??

J'utilise la technique du western blot afin de quantifier mes protéines d'intérêt (par chemiluminescence, révélation par l'ECL+ et analyseur d'image permettant de quantifier mes blots), mais une question se pose à moi. pourquoi dit-on du western blot que c'est une technique semi-quantitative Quelles sont les limites de la quantification.  [...] On streap la membrane et on effectue un immunomarquage de la protéine d'intérêt. Vous ne savez pas combien vous avez de protéine dans l'absolu. Mais le rapport prot d'intérêt/actine dans chacune des puits vous permet de dire qu'il y en a plus là que là. C'est relative ou encore semi quantitatif.  [...]

[Biochimie] Lampe de Wood et lecture de la DO

1) Lors d'une étude spectrophotométrique de l'hémoglobine et ses dérivés,pourquoi on effectue la lecture de la DO de 10 nm à 10 nm.   [...] 2) Que peut être l'interêt de la révélation par la lampe de Wood lors de l'exploration hormonale.  [...]

[Biochimie] Résultats de purification de lysozymes

Ensuite on a effectuer une électrophorèse, l'électrophorèse étant qualitative, il faut de forte concentration en enzymes (ça je le sais...) dans la fraction Fo (ya toutes les protéines) F1(adsorption) F2 à F4 (normalement que les protéines - voir rien du tout en F4) c'est le lavage, puis la désorption en F5 et F6 ( ou on ne doit avoir que du lysozyme au vue de mes résultats que j'affiche plus bas) tout a marché sauf en F4 où il n'y a que du lysozyme.  [...] Une autre question il faut une concentration minimal de combien en protéine pour souhaiter la voir en électrophorèse je dépose 25 ul de solution par puit.  [...]

[Génétique] comment savoir qu'un gène est sous silence

bonjour, J'ai un peu de mal à savoir comment on peut vérifier qu'un gène est bien mis sous silence. Je connais 2 méthodes pour cela.   [...] - induire la traduction puis réaliser un Western blot avec un anticorps, si il n'y a aucune révélation c'est qu'il n'y a pas de protéine et donc que le gène est sous silence.  [...]

[Biochimie] Question Western Blot et Coomassie

Jusque là pas de souci, en revanche, après transfert et révélation (Ac primaire et secondaire contre ma protéine). La bande s'observe cette fois aux environ de 10-11 kDa.  [...] En tout cas, la coloration au bleu de Coomassie ne peut pas être utilisée pour préjuger de la présence ou non d'une protéine d'intérêt endogène.  [...]