• Santé - Restrictions, Vecteur, ORF

[Biologie Moléculaire] Ajout de sites de restrictions

Ce qu'il faut faire c'est simplement prendre votre ORF et l'amplifier par PCR en ajoutant aux amorces les sites de restrictions+ 6 nucléotides aléatoires.  [...] En ce qui concerne pGEMT, il s'agit d'un vecteur pensé pour y cloner directement des produits PCR sans digestion de restriction ni ajout de sites.  [...]

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

On utilise des enzymes de restrictions pour isoler le gène d'intérêt, son promoteur, etc... et en parallèle on a recours à d'autres enzymes de restriction pour couper le vecteur.  [...] De manière général tout est inclut dans le vecteur. promoteur, terminateur, eventuels tag et MCS (sites de restriction) Il ne reste qu'à cloner l'ORF du gène qui vous interesse. Que vous aurez extrait avec des enzymes de restrictions et en parallèles vous ouvrirez le vecteur à l'aide des mêmes enzymes de restriction au niveau du MCS afin de générer des extrémitée compatible.  [...]

Comment orienter un fragment d'adn dans un vecteur

Donc pour cela je suppose qu'on peut utiliser des primers avec une partie 5' non complémentaire qui permet de générer un site de restriction différent selon le côté du fragment ce qui permet d'introduire le fragment dans le bon sens en utilisant les 2 sites différents.  [...] L'utilisation de sites de restriction est le seul moyen pour faire cela. Une autre solution est de ne pas orienter le fragment, et une fois le clonage fait tester les plasmides pour trouver ceux qui auront un insert dans le bon sens. Apres tout tu as 50% de chance que ton insert soit dans la bonne orientation.  [...]

Problème sélection kanamycine

J'essaie de sous cloner un gène dans le vecteur pADTRACK-CMV, donc un plasmide avec deux ORF, mais surtout une résistance à la kanamycine. Malheureusement jusqu'à maintenant j'obtiens toujours des tapis complet de colonie absolument partout et surtout même dans mes controles ne contenant que des bactéries (non transformées.  [...] Ça parait étrange quand même que toutes tes bactéries soient devenues résistantes. A moins que tu les fasses tout le temps pousser sur des milieux enrichis en kanamycine, c'est le genre de mutation qui a tendance à disparaitre, étant plutôt contre productive pour la bactérie.   [...]

[Biologie Moléculaire] qu'est ce qu'une ORF?

Les ORF sont definis strictement d'un codon stop a un autre, apres selon les organismes on defini une taille minimum. Les CDS vont des codons ATG au codon STOP. Une CDS n'est absolument une ORF prouvée experimentalement.  [...] Mais on ne m'a jamais sanctionné en fac quand je disais que j'avais 6 ORF et non pas 6 cadres de lecture. Encore pire. dans DNA strider, le menu qui permet de les définir s'appelle Find ORFs.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage en phase

Pour amplifier mon fragment OCI, je fais une PCR avec les amorces suivantes (aux quelles j'ai rajouté les sites d'enzymes de restriction car ils étaient absents de l'ORF).  [...] Je rejoins Piwi sur le fait que les enzymes de restriction sont des endonucléases. Allez faire un tour sur cette page pour voir quel est le nombre de nucléotides à ajouter avant vos sites de restriction pour que la réaction soit optimale.  [...]

Bioinformatique - Etudes d'une sequence d'ADN

Et je cherche tous ce qui pourrait me permettre de caracteriser cette sequence pour pouvoir la comparer ensuite que ce soit des criteres connus et evidents tels que la presence de site de restriction ou les pourcentage de nucleotides ou meme n'importe quelles idees.  [...] Tu peu xtoujours t'amuser a rechercher le site de restriction EcoRI, mais c'ets vraiment du temps perdu...Tu peux t'amuser a recherche la probablite de codage d'une sequence, mais ca ne te renseignera pas sur une quelqueconque similitude avec un autre virus.  [...]

ORF = code forcément une protéine ?

Une ORF cest un gène putatif. Il n'y aura pas forcément de transcription ni de traduction. Une ORF se limite au contenu entre un start et un stop, et y'en à un paquet.  [...] Exactement. Après, si on trouve une ORF de plusieurs centaines de bases, il y a de fortes chances que cela donne un transcrit. Quand on recherche des ORF, les très courtes ne correspondent en général a rien et les longues sont des gènes.  [...]

taille du génome.

Il faut rester prudent avec ces estimations, toutes les ORF ne sont pas connues. On se rend compte de plus en plus qu'un ATG n'est pas toujours nécessaire pour démarrer la traduction et il nous manque peut-être beaucoup de gènes.  [...] Le HCMV est le cytomégalovirus humain, c'est à dire que l'étape de traduction fait appel à la machinerie de traduction d'homo sapiens. On estimait avant cette étude qu'il y avait 220 protéines différentes, ils en ont déterminé environ 700. La différence s'expliquait par des traductions sur d'autres phases de lecture, par des démarrages de traduction ailleurs que sur des ATG ou bien sur des ATG en aval d'un ATG précédemment identifié.   [...]

[Microbiologie] Problème pour l'analyse d'un article

Toujours en gras, tu ne voulais pas plutôt dire une suppression de bases. Il est vrai qu'une suppression d'exons peut changer le cadre de lecture d'une ORF en aval de cet exon, mais ce n'est généralement pas ce qu'on recherche de façon évidente.  [...] Je suis étonné que vous fassiez ce genre d'exercice sans connaitre la définition d'ORF. En plus, tu vois les cadres de lecture dans le contexte de ce genre d'exercice, plutôt que de les voir dans un contexte plus général de traduction d'un ARNm avec tout ce que cela implique (région 5'-UTR avant de rencontrer le bon ATG, le bon ATG étant celui qui génère dans la plupart des cas l'ORF la plus longue,  [...]