• Santé - Restriction, Digestion, Vecteur

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

contrôle-qualité de l'ADN recombinant. transformation dans E. coli, sélection des clones recombinants et extraction du vecteur d'expression.  [...] Une banque d'ADNc correspond aux clonages de tous les ADNc obtenus dans un vecteur. Cette banque est alors utilisée dans un crible afin d'identifier le clone possédant le(s) gene(s) recherché(s). Une fois les clones identifiés, il s'agit de preparer les plasmides et de les sequencer afin de caracteriser le fragment cloné.  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr sur colonies clonage

Quand je clone, je crible mes clones sur colonies et je ne séquence que 2 ou 3 clones qui sont positifs en PCR. D'ailleurs j'utilise toujours une amorce dans l'insert, l'autre dans le vecteur pour être sûr de la nature de mon vecteur, de mon insert, de la taille de mon insert et de sa position dans le vecteur.  [...] J'ai utilisé la kit Qiagen avec succès pour extraire mon produit de PCR du gel d'électrophorèse. En revanche, je ne connais pas les autres kits. Je n'ai pas fait de clonage depuis maintenant deux à 3 ans, mais dans mon souvenir, je ne faisais pas de purification après la digestion, mais la ligation directement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de ligase?

Le traitement phosphatase évite effectivement la recircularisation de ton vecteur (le petit bout de linker entre tes deux sites de restriction traîne toujours dans le tube). Si tu as une phosphatase thermosensible, ça vaut le coup de chauffer la réaction avant l'extraction au phénol.  [...] La PO4ase alcaline d'intestin de veau (CIP) fonctionne très bien dans tous les tampons d'enzymes de restriction. Pour déphosphoryler un vecteur, j'ajoute une pouillette (0.5 ul sans me poser de question, c'est toujours un large excès) de PO4ase directement dans la réaction de digestion 1/2 heure avant la fin de ma réaction de digestion et je termine l'incubation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Dans tes colonies vecteur+insert il y en aura forcément sans insert (à verifier par PCR ) Si ton vecteur a été digéré par 2 enzymes de restriction différentes, il ne pourra pas se refermer, même avec ligase. Donc dans ce cas précis il ne devrait pas y avoir de colonies sur ton contrôle.  [...] Tu as donc fait une simple digestion de ton vecteur (une seule enzyme de restriction) =. il peut donc se recirculariser tout seul ou avec ligase (voilà qui répond au post de Wobinet).  [...]

Confirmation de l'insertion d'un gène dans un plasmide

Je travaille actuellement sur un clone et je veux savoir s'il est possible de confirmer une ligation entre un gène et un vecteur plasmidique et par quelle méthode puis¬je la faire.  [...] Oui c'est toujours comme cela que l'on fait d'ailleurs. On établit la carte de restriction du plasmide en utilisant des enzymes de restriction. A minima, une enzyme de restriction qui ne coupe qu'une fois permettra de linéariser le vecteur et d'en trouver la taille en faisant migrer le produit de digestion dans un gel d'agarose.  [...]

suggestions sur clonage site de restriction

je voudrais insérer mon insert dans un vecteur pcDNA. une digestion avec 2 enzymes de restriction EcoRI et XbaI a permis d'extraire mon insert contenu dans un vecteur de clonage pGEM et d'autre part de linéariser le pcDNA vide.  [...] sachant que ce n'est pas un problème d'enzyme et que le site de restriction est bien présent car vérifié par séquançage, quelles peuvent être les raisons de ce problème.  [...]

[Biochimie] Insertion vecteur

la digestion de restriction. Tu choisis un site unique du vecteur qu'on retrouve aussi dans l'insert, tu digères et en fonction du nombre et de la taille des fragments tu peux dire s'il y a insertion et même si elle est bien orientée.  [...] Ok.merci on a choisi la PCR avec des amorces car la digestion de restriction je ne l'ai pas vu en cour. Par contre l'autre soucis c'est de savoir ensuite si je choisi une PCR/RFLP ou PCR/RAPD car meme avec les avantages et inconvénients des 2 je n'arrive pas à choisir.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de clonage avec pT7Blue

On obtient un gel avec des produits de PCR de colonies bleues et blanches, de plasmides digérés par enzymes de restriction et des plasmides non digérés provenant de colonies bleues et blanches. (= 6 bandes)+marqueur de taille.  [...] une étape de digestion (ouverture) de ton vecteur plasmidique (là où tu as inséré ton produit de PCR) par diverses enzymes de restriction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Meilleure résolution pour gel d'agarose

J'ai commandé un gène dans un plasmide avec les site de restriction qui vont bien de chaque côté et comme j'ai beaucoup de chance, il se trouve que le vecteur qu'il m'ont envoyé contient également ce fameux site de restriction. Je me retrouve du coup avec 3 bandes au lieu de 2 sur mon gel après digestion.  [...] Une autre solution vient de me traverser l'esprit. faites une mutagénèse du site de restriction qui vous embête pour le flinguer.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ajout de sites de restrictions

En faisant comme cela, vous allez récupérer votre ORF borné par les sites de restriction. Vous n'aurez plus qu'à digérer et cloner directement dans votre plasmide d'intérêt.  [...] En ce qui concerne pGEMT, il s'agit d'un vecteur pensé pour y cloner directement des produits PCR sans digestion de restriction ni ajout de sites.  [...]