• Santé - Restriction, ARNm, Vecteur, Clonage

[Génétique] Obtention de sonde plasmide

2) Je ne trouve aucun enzyme de restriction qui corresponde entre mon ARNm et les différents vecteur de clonage disponible sur le marché. Comment faire Selon mon prof c'est très simple (pour lui tout est simple) il suffit juste de choisir un plasmide et deux enzymes de restriction au pif, et de rajouter les nucleotides correspondant aux 2 bout de ma sonde. Comment je fais ca moi.  [...] 2. TA ou GC cloning ne nécessitent pas d'avoir des sites de restrictions interessants dans l'insert. Si vous ne voulez pas utiliser ces solutions, pensez à la PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage par PCR taille des amorces

En revanche on conseille de rajouter quelques bases entre le le site et l'extrémité 5' de façon à internaliser le site car les enzymes de restrictions sont des ENDOnucléases, il faut que leur cible soit au milieu.  [...] Ce que je fait en général, c'est de cloner la séquence amplifié avec la présence des sites de restriction dans un vecteur de clonage pour fragment PCR. Ceci permet d'avoir des morceau d'ADN de part et d'autre des sites de restriction. Je clone ensuite le fragment dans mon vecteur d'expression.  [...]

[Biologie Moléculaire] PB ADN dans le puit d'agarose

Je commence mon 1 er clonage, donc pour faire court j'ai coupé mon vecteur avec une enzyme de restriction ApaI, qui devrait le linéariser.  [...] Alors quoi faire, je ne pense pas que ce soit la quantité d'ADN car j'ai refais le même protocole avec un autre vecteur et cela fonctionne.  [...]

[Biologie Moléculaire] Gène0 AOX1!!

1) Enzyme de restriction spécifique à AOX1 ainsi qu'au plasmide vecteur de clonage. Donc découpage des deux au bon endroit.  [...] En effet je n'ai pas très bien compris les mécanismes qui menenet à la multiplication des plasmides vecteur de clonage qu'on insère dans une bactérie.  [...]

Clonage par PCR

J'ai une petite question... j'aimerais savoir a quoi correspond exactement l'expression clonage par PCR. Est-ce quand on ajoute en 5' de l'amorce la sequence specifique d'un site de restriction, ce qui permet ensuite de liger le produit de pcr dans un vecteur contenant le meme site de restriction (en resume) Ou bien est-ce autre chose.  [...] Je pense qu'il s'agit tout simplement d'un clonage à partir d'ADN que tu as amplifié par PCR q'il s'agisse d'une ligation après digestion enzymatique ou autre.  [...]

[Biologie Moléculaire] blunt-end ligation

Je dois réaliser un clonage assez classique. J'ai mon insert amplifié via la Phusion (et les amorces ne comportent pas d'ajouts d'enz de restriction en 5', c'est juste pile le gène d'intéret qui était dans un autre plasmide). J'ai mon vecteur de destination.  [...] Il vaut mieux déphosphoryler le vecteur parce qu'une ligation intramoléculaire est énormément plus probable qu'une ligation intermoléculaire. Il faudra bien entendu vérifier l'orientation de l'insert dans le vecteur (PCR ou digestion, pour cela il faut un site extérieur et un site intérieur a l'insert mais qui ne soit pas au milieu.).  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

L'objectif de ce clonage est de récupérer une partie d'un vecteur, pour se faire une amorce foward a été faite pour pouvoir intégrer un nouveau site de restriction, l'amorce reverse elle doit intégrer plusieurs sites, l'insert que l'on doit obtenir doit faire environ 1500-1600bp.  [...] Franchement si ça déconne arrêtez de perdre du temps et faites synthétiser la séquence. Pour 1500pb il y en a pour 500¬, c'est vraiment rien. Et en plus vous pourrez vous amuser à mettre sites de restrictions, mutations, etc, ou vous voulez et à votre convenance.  [...]

suggestions sur clonage site de restriction

je voudrais insérer mon insert dans un vecteur pcDNA. une digestion avec 2 enzymes de restriction EcoRI et XbaI a permis d'extraire mon insert contenu dans un vecteur de clonage pGEM et d'autre part de linéariser le pcDNA vide.  [...] sachant que ce n'est pas un problème d'enzyme et que le site de restriction est bien présent car vérifié par séquançage, quelles peuvent être les raisons de ce problème.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

Ainsi tu te retrouves avec un ARNm possédant en 5' et en 3' des sites de restriction connus et différents, ce qui te permet de débuter ton clonage plus efficacement et de choisir un clonage orienté.  [...] Hormis certaines remarques faites ci haut,on doit prendre aussi en compte le fait que le clonage depend de l'objectif du travail.Si par exemple on veur cloner l'ORF tout entier,on fait le choix de 2 sites de restriction enzymes teste au prealable car les 2 sites,il ne faut pas que ils se retrouvent dans le gene,en plus pour l'orientation du gene et aussi en fonction de disponibilite des enzymes de restriction au laboratoire.  [...]

[Microbiologie] Taille de plasmide

j-ai les enzyme de restriction BamHI,EcoRI et PstI,COMMENT SAVOIR ESQ CES ENZYMES ONT DES SITES DE RESTRICTIONS POUR LE PLASMIDE pGEM-T ET SI C-EST OUI COMBIEN DE SITE SVP DES REPENCES SONT LES BIENVENUE.  [...] C'est facile pGEM-T est un vecteur de sous-clonage commercial. La carte plasmidique est disponible sur internet. A partir de là un enfant de 6 ans trouverai le nombre de site de restriction pour ces 3 enzymes.  [...]