• Santé - Référence, Protéine, Plasmide

Alignement séquence (Bioinformatique)

Dans notre labo, nous avons commencé à faire du séquencage de protéines. Nous recevons les données et nous les alignons avec une séquence de référence dans NCBI pour savoir si notre protéine est bien présente dans notre plasmide. Le séquencage n'est jamais parfait alors, lorsque je fais ces alignement jobtiens pleins de fragment des séquences homologue.  [...] Salut, oui il y a notre protéine que nous avons transfecté dans un plasmide. Nous l'avons verifier par blast avec la sequence de cette protéine de NCBI (reference). Et nous obtenons pleins de petits fragments d'alignement, ce qui est normal puisque lors du séquencage le logiciel fait pleins d'erreurs et donc l'alignement ce fait moins bien, ce qui crée ces fragments.  [...]

TP sur les plasmides

Après une culture bactérienne on a trouvé qu'E. coli était responsable et plus particulièrement un plasmide afa-3, qui code pour l'adhésine (protéine qui est responsable de la diarrhée -en gros-).  [...] Après avoir réalisé une courbe étalon (graçe au poids moléculaire de référence), on a déterminer la taille de nos fragments expérimentaux. On compare ces tailles en bp (paire de bases) aux fragments de référence, et on dit que si au moins 3 fragments expérimentaux ressemblent à 3 fragments de référence, alors on a à faire au même plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Exprimer une protéine fonctionnelle en plasmide

Pour m'assurer que ma protéine est fonctionnelle je dois insérer la séquence de mon cDNA du codon ATG au codon stop… jusque là ok.  [...] Mais seul le cDNA suffit à exprimer la protéine nan En considérant biensur que le promoteur soit déjà dans le plasmide Parce que en fait je ne comprends pas bien l'histoire de l'intron avant l'ATG.  [...]

[Biologie Moléculaire] Epidémie de diarrhées (tp)

Bonjour, je suis en L1 biologie et j'ai des questions à propos d'un test moléculaire fait en cours sur les souches des bactéries causant la diarrhée. Nous avons vu que la plupart du temps elle est due aux gènes invasive et adhésine. Nous avons réalisé une électrophorèse des plasmides des malades, nous savons qu'il y a deux souches différentes de bactéries causant la diarrhée et notre but est de savoir si la diarrhée étudiée est causée par l'invasine et l'adhésine en comparant la tailles des fragments d ADN qui ont migré avec la carte de restriction de l'invasine et adhésine.  [...] Non parce-qu'il me semble qu'ont ai à faire au même plasmide de référence si au moins trois fragments expérimentaux présentent une similitude avec trois fragments de référence.  [...]

[Biologie Moléculaire] Phosphorylation sur tyrosine => dégradation par protéasome???

Alors en fait cette protéine est bien ubiquitinylé (.) par des complexes qui reconnaissent des sérines phosphorylées sur cette protéine. Pour ce qui est du MG-132 je n'ai pas encore fait le test. sinon pour ce qui est de la compétition d'expression j'ai fait un contrôle de transfection en cotransfectant le plasmide de la protéine X avec le vecteur d'expression vide de la protéine Y et de plus lorsque je cotransfecte le plasmide de ma prot X avec le plasmide de la kinase Y inactive j'ai l'effet inverse c'est à dire une accumulation d'X.  [...] La démonstration qu'une protéine est phosphorylée, doit s'appuyer sur un ensemble de manipes qui vont dans le même sens. Ces manipes doivent être réalisées dans des systèmes différents avec des techniques et des tactiques d'approches différentes de sorte qu'en regroupant l'ensemble des résultats on puisse affirmer que la protéine en question est phosphorylée, mais ceci est valable pour n'importe quelle question scientifique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent Clonage

Nous avons reçu un nouveau plasmide, je dois y faire exprimer une protéine. L'insert d'interet est exprimé dans un autre plasmide.  [...] La protéine que je veux exprimer doit avoir une GFP et un tag His, ces deux là sont déjà dans le nouveau plasmide, mai puisque je dois synthetiser mes amorces avec un codon stop, comment ces tags peuvent-ils etre lus.  [...]

[Génétique] Transfection transitoire plasmide/siRNA

Ma question concerne les mécanismes qui se mettent en place après une transfection transitoire d'un plasmide codant pour une protéine ou d'un siRNA. Je m'explique. quand on transfecte un plasmide d'expression codant pour la GFP par ex c'est transitoire cad qu'au bout de 48H la fluorescence commence à disparaître (dilution globale ou par cellule) que se passe-t-il pour la descendance.  [...] - la disparition progressive de la fluorescence est-elle due à la dilution de la population ou à la dégradation du plasmide et de la protéine exprimée. quelle cinétique.  [...]

Transfection et récupérer protéine

je pensais à transfecter une cellule CHO avec un plasmide contenant l'ADNc. La machinerie cellulaire va synthétiser la protéine mais ensuite comment isoler et purifier la protéine.  [...] Il faut faire attention lors de la synthèse, choisissez bien votre promoteur, cherchez dans la littérature il doit exister des constructions particulières pour les protéines membranaires. Faites également très attention au détergent que vous utiliserez lors de l'extraction pour essayer de la garder votre protéine la plus soluble possible.  [...]

[Biologie Cellulaire] Dominant négatif

bonjour tout le monde, est ce que quelqu'un peut m'expliquer comment ça marche concrètement une expérience de dominant négatif j'ai ma lignée cellulaire ou je veux éteindre ma protéine, je les transfecte à l'aide d'un plasmide contenant la séquence mutée et je la trouve ou cette séquence et le plasmide ça s'achète ma question est peut être bête mais je n'ai jamais fais ça alors j'ai besoin d'éclaircicements, merci.  [...] Où trouver un dominant négatif Soit il est déja caractérisé dans la littérature, auquel cas tu peux contacter le labo qui a publié pour avoir le plasmide, ou bien il est commercialisé, sinon, il faut le faire. La ce sera de la mutagénèse dirigée, mais concernant le site à muter, cela dépend de la fonction de ta protéine que tu souhaites éteindre.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transfection et induction

Alors voilà, pour commencer j'envisage de faire des trasfections de HEK 293 par un plasmide codant une protéine parasitaire et conférant un tag HA afin de voir si elle active la voie NF-kB (gràce à un plasmide rapporteur et test luciférase).  [...] Pour être plus précise on m'avait conseillé aussi d'utiliser une protéine dont je sais qu'elle n'active pas cette voie, elle-même taggée HA. Malheureusement je n'en ai pas de disponible en ce moment. Mais d'après ce que tu me dis, ce n'est pas nécessaire. mon vecteur vide est un suffisament bon contrôle, c'est ça.  [...]