• Santé - Quantité, Tampon, Protéine

[Biologie Moléculaire] gel 1D

pourtant après dosage la quantité de protéines semble suffisante j'ai par exemple 1.6µg/µl je ramène tout les échantillons à cette concentration, j'ai engagé une plus grande quantité de protéine 65µg. j'ai vérifié les pH des tampon tris pour les deux gels (concentration et séparation) je travaille avec la même source.  [...] je voudrai savoir aussi si le fait de d'augmenter la tension un peu peut provoqué ça je fais ça parfois quand je viens le matin pour activer la migration, mais j'ai toujours eu l'habitude d'avoir de beau gels.   [...]

[Biologie Moléculaire] Pull down GST

Si ta production n'est pas très grande, attention toutefois à la quantité de billes nécessaire, car plus il y a de billes, plus tu augmentes la possibilité d'intéractions aspécifiques avec les billes. Ta protéine est elle soluble Car il se peut aussi qu'elle soit produite en grande quantité, mais non solubilisée dans le tampon d'extraction.  [...] La quantité nécessaire dépend de plein de paramètres, dont le poids moléculaire de la protéine d'intérêt (plus son PM est petit, moins il y a en besoin, car plus il y a de mole/µg), la force d'intéraction avec le partenaire, du type de détection (western blot, autoradiographie).  [...]

Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

La sérine aurait une possibilité d'intéragir au niveau structurel avec un autre aa de ta séquence malgrè la présence de dénaturant Même si au moment de l'injecté elle est dénaturé, le fait que le tampon de migration dilue le composée dénaturant et imaginant que ta protéine a une vitesse de reconformation 3D rapide, alors il est possible que.  [...] Il ne devrait pas y avoir de renaturation de la protéine durant la migration puisque normalement noirdez a coulé des gels contenant du SDS pour migrer en condition dénaturante, et le tampon de migration contient une quantité élevée de SDS. La seule renaturation qui peut avoir lieu est, a priori, durant le transfert car on dissocie le SDS de la protéine.  [...]

western-blot

Je fais également des western blot et j'ai le même problème que toi. je resuspend mes protéines directement dans le tampon de charge donc je ne peux pas quantifier la quantité de protéines que je dépose sur gel.  [...] tu peux couper ton gel en deux. Une partie de ton gel va être colorée au bleu de Coomassie et l'autre partie va être transférée sur membrane. tu peux grâce à la coloration au bleu déterminer si tu as déposé une quantité équivalente de protéines sur gel.  [...]

[Biochimie] Casser des aggrégats

Mes cellules surexpriment en effet ma protéine, je travaille sur des cellules BHK et j'utilise le tampon RIPA comme tampon de lyse.  [...] D'habitude, une fois le tampon de Laemmli ajouté, je dénature 1h à T° ambiante pour cette protéine. Et les résultats en western sont très satisfaisants, une belle bande.  [...]

dégradation de protéine recombinante

Pour la quantité d'EDTA à mettre, ça peut être un peu tordu. Disons qu'il faudra faire attention si ta protéine contient des cations divalents, elle pourrait ne pas trop apprécier le traitement (mais ça peut très bien se passer aussi). Je commencerais à 2 ou 5 mM, ça me semble le plus sur.  [...] Si tu fais une echangeuse d'ions, ça ressemble beaucoup plus dans le principe à une colonne de Ni. C'est un peu plus compliqué à mettre au point, mais ça sépare souvent plus efficacement quand on sait s'en servir. Dans ce cas, tu fais circuler le même tampon A avec la protéine.  [...]

[Biochimie] Tampon de purification, NaCl et KCl

Je fais une purification par chromatographie d'affinité d'une protéine, qui était jusqu'à présent dans un tampon Tris + NaCl 0,4 M, du glycerol, et de l'imidazole.  [...] La protéine étant plus stable dans le PO4 (que dans le Tris), je suis passé à un tampon K2HPO4 / KH2PO4. Pour éviter d'introduire trop d'ions différents, je voudrais utiliser du KCl à la place du NaCl. Je constate que dans la littérature, il est fréquent que celui-ci soit utilisé à des concentrations moindres, mais je ne trouve la raison nulle part.  [...]

[Biologie Cellulaire] Extraction protéique pour western blot

Même si mon protocole est peut être trop long, il est néanmoins complet, et peut être fait en une 1/2 journée. Au moins, il pourra comprendre toutes les étapes, savoir ce qu'il y a dans le tampon, savoir combien il mets de protéines pour son gel... Bien sûr que c'est pas primordial pour juste vérifier si ta prot est bien là dans ton extrait, mais bon, j'imagine que si sa manip marche, il va devoir en faire d'autres, avec peut-être plusieurs boites, donc il faudra mettre une quantité équivalente pour chaque puits.  [...] S'il veut être dans une quantité de protéines raisonnable pour le dépot, il faut qu'il dose au moins une fois pour connaître la quantité moyenne qu'il récupère. Dans le tampon laemmli, comme tu l'as dit, on ne peut pas doser à cause du bleu (et encore, même sans bleu.  [...]

[Biochimie] Calcul de concentration de la protéine dans un échantillon (Exo L1)

le tampon de stockage utilisé et les autres acides aminés présents dans la protéine n'absorbent pas signifcativement la lumière UV à 280 nm.  [...] d) quelle serait la densité optique du même échantillon après hydrolyse acide prolongée (en supposant que ce traitement ne dilue pas l'échantillon).   [...]

[Biochimie] purification proteines

Voila j'ai une question qui m'est venue à l'esprit. pourquoi utilise t-on du beta-mercaptoethanol dans le tampon d'elution d'une proteine et dans le tampon de dialyse. Je pensais que le beta-mercaptoethanol etait une reducteur qui denaturait la proteine donc à la fin de la purif la proteine devrait donc être inactive.  [...]