• Santé - Quantité, Plasmide, Solution

[Biochimie] Calcul d'une concentration en ADN

Le but de l'exo est de déterminer la quantité d'ADN plasmidique dans une solution de 100mL. On sait que la taille du plasmide est de 3500pb. On introduit dans la solution des enzymes qui détachent les sucres, bases et phosphates les uns des autres, puis on détermine qu'il y a 9,8g d'unité osidique dans la solution.  [...] J'ai compris comment déterminer la masse d'ADN présent dans la solution, à partir de la masse d'unités osidique. J'ai également compris comment déterminer la quantité de matière de plasmide à partir de la taille de celui-ci et je vous en remercie d'ailleurs car c'était pas gagné.  [...]

Precipitation adn plasmidique

Bonjour, après une extraction d'adn plasmidique avec un kit qiagen, je me retrouve avec de faibles concentrations de plasmide. Je souhaterais donc le concentrer un peu afin de pouvoir par la suite le sequencer.  [...] Autre solution tu rajoute a ta culture sur la nuit un peu de chloramphenicol pendant quelques heures. Ca bloque la multiplication des bacteries mais n'affecte pas pas la replication de l'ADN. donc tu augmente la quantité de plasmide dans tes bacteries.  [...]

[Microbiologie] Correction Dilution en cascade (solution plasmidique)

Quand je calcule la concentration je trouve 10ng.µL ce qui correspond bien à 200ng dans 20µL. Donc l'échantillon total présente 200ng de plasmide. Ensuite on prélève 10µL de solution à 10ng/µL soit 10*10 = 100ng que l'on dilue dans 10µL d'eau (Vt = 20µL) on obtiens une solution de 5ng/µL.  [...] En fait je me suis trompé au départ ce n'est pas une solution de 200ng/µL mais une solution contenant 200ng de plasmide. Pourquoi d'ailleurs partons nous de cette solution et pas directement de la solution contenant 100ng de plasmide (ce qui reviendrait à mélanger 2µL de la solution de départ avec 18µL d'eau).  [...]

[Biologie Moléculaire] pb de mutagenèse dirigée

je travaille avec un plasmide type pcDNA3 de 4.5 Kb dans lequel g mis l'ADNc du gène du facteur Willebrand (8.9 Kb). l'amorce que j'utilise fait 30 b avec 15 bases de chaque coté de la mutation et elle a été commandée sur le site recommandé par Stratagene, donc je pense pas qu'il y ait un problème à ce niveau.  [...] mon problème est que je n'obtient pas de colonies avec mon plasmide recombiné, les témoins de mutagenèse et de transformation sont OK, j'ai bien des colonies bleues et blanches. mais les bactéries traitées avec mon plasmide ne poussent pas sur le milieu de culture LB+ampicilline quelque soit la quantité d'ADN ou de solution bactérienne étallée.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

J'avais eu le même probléme l'année derniére, en plus moi je faisais des litres de culture, je ne te raconte pas la galére. Pour moi c'était. BL21 Star(DE3), plasmide pGEX-2T avec fusion GST-toxine bactérienne, promoteur tac et induction á l'IPTG. Finalement la solution dans mon cas pour avoir une assez bonne quantité de protéines recombinantes, était d'induire á une DO tardive de 1.  [...] Dans ce cas, si la production a déjà marché avec le même plasmide et la même souche bactérienne, le mieux est de refaire tous vos tampons, les stocks d'antibio t d'IPTG... et de recommencer. Si un tampon a été mal fait, ça ira plus vite de refaire des nouveaux tampons que de trouver l'erreur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination d'ARN par de l'ADN

J'ai prévu de refaire des tests avec des souches ne possédant pas de plasmide et de rajouter une quantité de plasmide en DNasant ou non les extractions.  [...] Le test que je suis en train de réaliser consiste à extraire les ARN totaux d'une souche et de rajouter à l'extraction une quantité de plasmide précise (je précise que je cherche les ARNm correspondant à la transcription de mon plasmide). Cette quantité de plasmide est soit DNasée soit non DNasée puis une PCR sera réalisée directement sur ARN (sans RT), cela me permettra de jauger l'efficacité de la DNase du moins je l'espère.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Voilà, donc pour les infos. mon insert fait environ 700 pb, et je vais utiliser comme vecteur le plasmide pBluescript SK, et je sais quelles enzymes je vais utiliser. Si vous avez une idée de protocole, des quantités, des temps d'incubation et tout je suis preneuse.  [...] Ensuite mettez vos ADN de sorte d'avoir grossièrement la même quantité (on parle en quantité pas en masse) des uns et des autres (Par exemple 500ng de plasmide. la photo vous y aidera). Completez si besoin avec de l'eau et là deux écoles.  [...]

[Biologie Moléculaire] Essais luciferase promoteur miRNA

La question que je me pose est la suivante. Etant donne que l'expression des miRNA est differente des mRNA (a priori plus faible), est ce qu'il ne serait pas judicieux d'augmenter la quantite de plasmide promoteur+luciferase dans mon experience (par rapport au protocol pour promoteur mRNA).  [...] Si quelqu'un a deja fait un essai luciferase sur des promoteurs miRNA, je suis interesse pour savoir la quantite de plasmide utilise (par rapport aux autres plasmide transfectes).  [...]

[Biologie Moléculaire] Calcul d'unités enzymatiques

Je dois calculer la quantité théorique d'enzyme de restriction Bam HI et Hind III a utiliser pour digérer 1 microgramme de plasmide pSK et 1microgramme de plasmide pCR-gai ds les conditions standards.  [...] Je connais la définition d une unité d'enzyme de restriction mais je ne comprends pas comment interpréter 1microgramme d'ADN du phage lambda alors qu'on nous donne 50kpb... Y a t il une conversion a faire.   [...]

[Biologie Cellulaire] Aide calculs de dilution biocell immuno

Vous disposez d'un plasmide contenant le cDNA codant pour la proteine Z nommé pcDNA. Pour transfecter transitoirement des cellules COS avec ce plasmide il vous faut préparer 1mL d'un mélange de transfection. Le tableau ci dessous récapitule la composition de mélange à préparer ainsi que les cincentrztions des solutions stocks.  [...] Pour le plasmide ta réponse est bonne mais le raisonnement n'est pas bon, le facteur de dilution n'est pas important. On te demande juste d'avoir 10µg, donc avec une solution mère à 100µg/mL pour avoir 10µg il faut prélever 0.1mL.  [...]