• Santé - Quantité, Amorces, Cycles

[Biologie Moléculaire] Courbes PCR en temps réel

Alors petit rappel. le principe de la PCR quantitative est qu'on est capable de suivre l'évolution de la quantité d'amplicon formée au fil des cycles. Pour cela, on a une matrice, une paire d'amorces ciblant la région que l'on veut amplifier, une enzyme, des nucléotides, et un colorant fluorescent de l'ADN.  [...] Cette PCR est dite quantitative, puisque vu qu'on est capables de savoir a tout moment combien on a synthétisé d'ADN dans le tube, on peut déterminer la quantité initiale de matrice. Cette quantité initiale est déterminée a partir du nombre de cycle nécessaire a ce que l'intensité de fluorescence atteigne un certain seuil.  [...]

[Microbiologie] Viabilité d'une bactérie et ARN - Page 2

Les temps de polymérisation en qPCR sont trop court pour pouvoir amplifier un intron souvent supérieur à 1 kb. En procédant comme dit Flyingbike, tu n'auras pas de problème a priori. Une faible quantité d'ADNc est suffisante pour la qPCR donc à ta place je tenterais le coup en faisant une petite qPCR de tes ADNc en prenant des amorces ciblant un gène bien exprimé comme l'ARN 18S.  [...] à ta place je tenterais le coup en faisant une petite qPCR de tes ADNc en prenant des amorces ciblant un gène bien exprimé comme l'ARN 18S. Si le Ct sort tard (au-dessus de 25 cycles pour ce gène cela me parait déjà tard), alors tu pourras déduire que ta quantité d'ADNc est insuffisante.  [...]

[biologie moléculaire] PCR à partir d'ADN génomique

merci pour l'aide.. En fait vu que je suis assez limitée en matériel (ADN extrait d'échantillons de tumeurs humaines) j'étais parti avec 5-10ng lors de mes premiers essais mais sans résultat. Je me disais donc que c'était peut-etre parce que ma quantité d'ADN de départ était insuffisante car visiblement quand il s'agit d'ADN génomique il faut un petit peu plus forcer la dose et j'avais l'intention de réessayer avec 100ng donc piwi tu me confortes dans mon idée.  [...] si tu es limité par la quantité d'ADN, tu peux aussi augmenter la quantité d'amorces et augmenter le nombre de cycles (n= 35 à 40).  [...]

[Biologie Moléculaire] problème de PCR!!!?

J'ai fait une PCR et sur le gel d'agarose les bandes des amorces sont trés intenses alors que seulement une bande qui correspond au pdt PCR d'un seul echantillon parmi 15 apparait.  [...] Dans les 15 Soit ton ADN est dégradé dans 14 puits, soit tu as mal fait ton dépot, soit ton mix est mal fait. trop d'amorces par exemple si tu as vraiment des bandes intenses pour les amorces.  [...]

[Biochimie] (licence/master) Question sur la pcr pour un rapport de stage, merci

C'est une PCR qui permet d'étudier la variabilité d'un gène. On utilise des amorces ciblant un gène homologue sur les différentes espèces puis on utilise une enzyme de restriction puis on compare le profil sur gel. C'est une méthode plus longue que les autres PCR.  [...] C'est une méthode de PCR récentes, qui utilise des amorces spécifiques, elles permettent d'amplifier plusieurs ADN cibles en même temps. L'ADN de chaque amplification est quantifié à tous les cycles par fluorescence spécifique pour chaque ADN cible. Il faut une connaissance du génome des différents parasites.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

tu veux les mettre dans un ordre précis La meilleure solution je pense est d'utiliser des amorces contenant des sites de restriction et de faire une ligation ensuite.  [...] Ensuite je vais faire une 2ème PCR en diluant le produit PCR 1 10-20-30-40-50 fois et en ajoutant les amorces. je vais bien finir par y arriver.  [...]

[Biochimie] PCR & Southern Blot

- Si le southern blot nécessite, le plus souvent, l'utilisation de sondes marquées radioactivement (pour pouvoir localiser, sur une électrophorèse, les différentes séquences), qu'en est-il de la PCR Les amorces utilisées sont-elles nécessairement marquées au préalable.  [...] - Il me semble que les polymérases de type I détruisent à un moment donné de la réplication les amorces. Pourquoi ces amorces ne disparaissent-elles pas progressivement durant les différents cycles d'une PCR.  [...]

calcul d'une quantité d'ADN- PCR

Dans un échantillon de 1 microg d'ADN, on a 1pg de fragment à amplifier. Quelle quantité d'ADN amplifié obtiendra-t-on après 30 cycles de PCR, en admettant un rendement de 10puisssance 6.  [...] Le doublement de la quantité d'ADN à chaque cycle est une utopie qui n'a lieu que si l'efficacité de la réaction est optimale (100%). D'où les chiffres énormes que tu obtiens HigginsVincent. Si telle était le cas, nous nous contenterions d'une dizaine de cycles.  [...]

[Biotechnologie] Principe de la PCR

quantité analysable d'ADN (environ 0,1 microgramme). Chaque cycle voit théoriquement doubler la quantité d'ADN présente au cours du cycle.  [...] Le choix de la durée des cycles de température et du nombre de cycles dépend de la taille de la séquence d'intérêt ainsi que de la taille et de la complémentarité des amorces. Il convient de réduire les durées au minimum non seulement pour un gain de temps mais aussi pour prévenir le risque d'amplification non spécifique.  [...]

qPCR

8 a 2.1 quelque chose comme ca approximativement, ce qui entraine une graaande difference lorsque tu fais du quantitatif, bien que en PCR classique tu t'en fiches un peu du moment que tu amplifie, donc que tes amorces soient spécifiques, c'est bien, mais ce n'est pas assez, il te faut vraiment l'efficacité, comme je te disais plus haut avec des amorces (spécifiques, bien bonnes et tout et tout) si l'une a une efficacité de 1.9 et l'autre de 2.1.  [...] Tu ne peut vraiment pas te passer de calculer l'efficacité des amorces avant de faire du quantitatif, enfin je ne le concois pas, c'est comme faire une PCR classique et oublier de mettre le BET (ou autre colorant) dans le gel, et dire après je ne vois rien c'est dans mon echantillon ya pas le gène en question.  [...]