• Santé - Quantité, ADN, Cible

[Biologie Moléculaire] Comment analyser les résultats de PCR quantitative???

La PCR quantitative se base sur le fait qu'à chaque cycle on double la quantité de la séquence cible. Et que pendant la phase exponentielle (quand aucun élément de la PCR n'est limitant) la quantité d'ADN cible à un cycle donnée est proportionnel à la quantité initiale de la cible.  [...] J'arrive à la précision du facteur 2. La PCR marche par cycle de doublement de la quantité d'ADN-cible. Au cycle c, on a n copies de la cible, au cycle c+1, on a 2n copies dans le tube. La précision de la mesure par l'appareil est de +/- 1 cycle, donc plus ou moins un facteur 2.  [...]

Normalisation RT-PCR quantitative

Pendant la phase exponentielle de la PCR, la quantité d'ADN double à chaque cycle, ce qui signifie qu'une différence d'un cycle entre 2 Ct correspond à une différence d'un facteur 2 des quantités initiales d'ADN cible. C'est le 1er delta de Ct.  [...] Réaliser la PCRq avec 3 dilutions de la même RT permet de vérifier que le nombre de copies du gène cible est bien proportionnel à la quantité de RT. Si ce n'est pas le cas, on a saturé la réaction (trop d'ADN -. diluer) ou on est dans le bruit de fond (pas assez d'ADN, mettre + de RT).  [...]

Housekeeping gene (gene de ménage)

Pour éviter cela, et vu que vous vous intéressez à la quantité de cellules, je propose de mesurer une quantité d'ADN génomique, qui ne varie pas et est toujours proportionnelle à la quantité de cellules (sauf exception). En mesurant n'importe quelle cible dans l'ADN génomique, on peut remonter a la quantité de génomes, et donc de cellules.  [...] On pourrait normaliser par la quantité totale d'ADN, bien plus facile a mesurer (pas besoin de qPCR par exemple), mais votre problème est que dans les selles il y a des cellules non eucaryotes pleines d'ADN qui sera quantifié en même temps.  [...]

[Génétique] PCR - Calcul du nombre de cycles

Je partirais du principe qu'un microgramme représente Da. Avec un amplicon de 2001 pb qui fait Da, on peut calculer le nombre de cycles nécessaires pour arriver à 1 microgramme si on commençait avec un seul template. Après, il suffit de trouver encore combien de templates on a dans notre échantillon de départ avec le fait qu'on a 10 ng d'ADN de 1 milliard de pb.  [...] Ensuite, vu que tu sais comment se comporte la quantité d'ADN a chaque cycle d'amplification, il suffit de calculer le nombre de cycles pour arriver a 1µg.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction ADN sur lame de paraffine

Je suis à la recherche d'infos pour optimiser mon extraction ADN à partir de lame tumorale incluse en paraffine. j'utilise un kit Qiagen. J'ai peu de tissu donc un rendement très faible ADN. 10 ug/ml. Ensuite la PCR de mon gène cible ne donne rien. Avez vous des trucs et astuce depuis le moment ou j'extrait de la lame jusqu'au moment ou j'élue pour augmenter ma quantité d'ADN purifié finale.  [...] Je ne connais pas ce kit mais il y a possibilité (si ce sont des colonnes) d'augmenter soit le rendement, soit la concentration en modifiant le volume d'élution, en faisant 2 élutions successives ou en utilisant du TE ou de l'eau a 40°.   [...]

[Biologie Moléculaire] bandes après electrophorèse

2-Après l'activité de la Taq, nous avons 2 goupes de fragments. le target DNA (fragment recherché) et l'autre groupe de fragments qui n'ont pas les mêmes mesures que le Target. Pourquoi sur gel,n'apparait uniquement que la bande correspondant au target et non les autres fragments.   [...] Parce que la coloration de tes échantillons se fait proportionnellement à la quantité d'ADN, du coup ta cible, présente à des milliers d'exemplaires, est très colorée, et les autres fragments sont si peu nombreux qu'ils sont invisibles et donc confondus dans le bruit de fond.  [...]

[Biologie Moléculaire] quantitative/real time PCR quelle différence?

La PCR compétitive est basée sur la co-amplification de la matrice d'ADN cible et d'une quantités données d'un ADN standard interne (compétiteur ) portant les mêmes sites de fixation d'amorces.  [...] Oui, à condition d'etre en phase exponentielle d'amplification. Ex. dans mes PCRq, a partir de 35 cycles environ, il y a un plateau, et la quantité d'ADN est identique dans tous les points et indépendante de la quantité initiale. Impossible de quantifier en fin de PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mise au point PCR en Temps Réel

j'ai effectué plusieurs PCR quantitative le but étant la mise au point des PCR, je sais pas comment interprété les resultats car mon stage arrive à sa fin et je ne peux pas aller plus loin dans mes experiences.  [...] (Ct = Treshold Cycle) de mes gènes de références est plus élevé que celui du gène cible. CT référence =32 alors que CT cible=24. Est ce que c'est normal ou bien il ya t-il des mise à point à faire, tel que la quantité d'ADNc ou des amorces Merci d'avance.  [...]

qPCR : Pourquoi soutraire le CT values et pas les diviser

J'ai compris par moi même finalement, en fait on divise bien la quantité du gène cible par le control (gapdh par ex), c'est juste qu'on a pas accès aux quantités mais aux CT qui sont des fonctions exponentielles de la quantité.  [...] Maintenant si on divise I0 du gène cible par I0 du gapdh, en simplifiant le tout on a le ratio R, qui est la quantité de cDNA normalisée par GAPDH.  [...]

En images : ils coupent de l'ADN grâce à CRISPR !

Cas9 est une protéine qui a une activité de nucléase, c'est-à-dire qu'elle peut couper l'ADN. La nucléase Cas9 se lie à un ARN guide qui cible un site précis de l'ADN. le système CRISPR-Cas9 peut couper l'ADN à un endroit précis. La sélection du site à couper se fait grâce à l' ARN guide associé à la protéine Cas9.  [...] Ensuite, les chercheurs ont observé comment le complexe Cas9-ARN ciblait l'ADN. Ils ont pu confirmer que le complexe s'associait au niveau d'un motif PAM de l'ADN. PAM est une séquence courte localisée près du site cible de l'ADN qui est complémentaire à l'ARN guide.  [...]