• Santé - Protocole, Protéines, Liquide, Western

Elution de protéines d'un gel de polyacrylamide

En premier lieu, j'ai découpé mon gel, mis dans un mélange Laemmli + bétamercaptoéthanol pour la nuit à 37°C puis j'ai réalisé un Western blot avec ces fragments de gel. Le problème c'est que ce n'est visiblement pas reproductible puisque la seconde fois je n'ai pas obtenu de bandes de protéines.  [...] Du coup j'aimerai savoir s'il existe un protocole grâce auquel je peux faire sortir/éluer toutes mes protéines virales de mes parties de gel afin d'avoir quelque chose de liquide contenant mes protéines pour ensuite les faire migrer en Western blot.  [...]

[Biochimie] extraction protéines, WB elastine murine

[Biochimie] extraction protéines, WB elastine murine.  [...] Je souhaite réaliser un Western-Blot afin de détecter l'élastine de souris. Sachant que l'élastine est une protéine insoluble, je recherche un protocole d'extraction de protéines à partir de tissus pulmonaires de souris qui me permettrait d'obtenir un maximum d'élastine soluble afin de faciliter sa détection par Western-Blot. Je vous remercie par avance de vos conseils.  [...]

[Biochimie] dot plot et overlay

J'ai cherché un protocole pour faire cette technique cependant je n'ai pas trouvé un protocole complet qui comporte le dot plot et l'overlay surtout que ceux qui font l'overlay commence par faire un western blot alors que moi j'évite de le faire pour ne pas dénaturer mes protéines.  [...] Pourriez vous m'aider à retrouver un protocole complet sur l'overlay et la concentration de protéines que je dois déposer.  [...]

[Biochimie] Modifications post traductionnelles et électrophorèse !

D'ailleurs j'en profite, pour une question a LXR qui bosse avec une grosse protéine, on travaille sur une protéine de 312KDa mais on a bcp de mal a la voir en western, est-ce qu'il y a des astuces de protocole quand on bosse avec des protéines de cette taille la.  [...] Non pas à ma connaissance. Pour mes protéines après migration à 80V dans le stacking et 130V dans le separating, je transfère en liquide pendant 1h30 à intensité fixe 350 mA, puis les autres étapes sont inchangées par rapport à d'autres westerns sur d'autres protéines.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins

Pour les extraits, j'utilise ce protocole sur du foie et sur des cellules, ça revient au même. Il faut faire attention a ne pas mettre trop de tissu dans le tampon, l'idéal étant de peser environ 30mg pour voir ce que ça fait. Grosso modo, une tete d'allumette dans 500µL et tu as de quoi faire des centaines de western.  [...] oui, je me ferai aider. Mais avant j ai quand meme besoin d un protocole.Le probleme c'est que je pars de rien. Dans le labo, ils ont dosè d autres proteines, pas celles la. De plus, ils le font souvent sur des cellules en culture. Cest pour cela que je suis un peu perdue. J'attens ton message demain.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

J'ai essayé le semi dry transfer 1h, 25 V et aussi le transfert liquide 35V overnight à 4°C. Mais dans tous les cas, je n'arrive pas à avoir des protéines de plus de 180 kDa.  [...] Personnellement, j'ai transféré efficacement une protéine de 350 kDa mais ça marche uniquement avec les systèmes de transfert à sec. La bande de marqueur à 250 kDa était elle seulement partiellement transférée dans les systèmes liquides et totalement dans les systèmes à sec.  [...]

Séparer membrane et cytoplasme

Bonjour, je suis actuellement en stage de M2R dans un laboratoire et je cherche un protocole me permettant d'isoler la fraction cytoplasmique de la fraction membranaire (peut contenir le noyau), sans avoir à passer par une étape d'ultracentrifugation (100 000g).  [...] Et bien mon boss veut que l'on mette au point un protocole rapide que l'on pourrait utiliser en continu et vérifier par western blot la localisation de la protéine. Il s'agit de contrôler où se situe ma protéine après avoir testé l'activité de la B-Gal dans un modèle HeLa dans différentes conditions.  [...]

[Biologie Cellulaire] Contrôler la pureté des protéines

Puis pour verifier la purete je ferais sur un gel d un cote une coloration au bleu de coomassie qui va colorer toute tes proteines et de l'autre un western blot avec des anticorps diriges contre la proteine que tu veux.. puis tu compare les 2 gels.  [...] Comparer un gel au bleu de Coomacie avec un western me parait être une bonne idée mais est-on sur que dans l'extrait protéique il n'y aura que la protéine que l'on veut étudier Si on utilise un anticorps contre notre protéine d'intérêt on ne verra qu'elle mais cela ne veux pas dire qu'il n'y a pas d'autres protéines que l'on ne voit pas.  [...]

[Biologie Moléculaire] Régulation de NFAT5

Donc l'idée est de faire une immunoprécipitation des protéines ubiquitinilées. Puis un western anti ubiquitine permet de voir l'ensemble des protéines précipitées. Ensuite, sur le même extrait on fait un western anti NFAT5 afin de savoir si il fait partie des protéines précipitées.  [...] La panneau input correspond à l'extrait protéique qui ne c'est pas fixé sur les billes (non immunoprécipité). C'est un contrôle qui permet de s'assurer que les protéines sont quand même présentes dans l'extrait au départ. Si on ne le fait pas on est jamais certain que NFAT5 est présent dans l'extrait initial et du coup un résultat négatif pourrait simplement correspondre à une absence de protéine.  [...]

western-blot

je suis entrain de faire des western sur des mutants afin de voir la différence d expression d une protéine dans ces lignees. Or je suis obligé pour cela de précipiter mes protéines sinon je n ai pas les quantites suffisantes.  [...] Je fais également des western blot et j'ai le même problème que toi. je resuspend mes protéines directement dans le tampon de charge donc je ne peux pas quantifier la quantité de protéines que je dépose sur gel.  [...]