• Santé - Protéine, Particulier, Tampons

surproduction et purification de proteine

_ Pour les tampons à utiliser je préfère laisser la parole à qqn d'autre, j'ai produit de la protéine transmembranaire alors c'était très particulier je pense les tampons que j'ai utilisés.  [...] Pour débarrasser ma protéine des acides nucléiques qui y étaient liés (peut-être auras-tu ce soucis également), je faisais d'abord un pic de NaCl (10 mL de 300 mM à 2M puis de 2M à 300 mM), lavage de la colonne avec 20 mL de tampon. Elution avec un gradient d'imidazole (20 mL de 0 à 250 mM).  [...]

[Immunologie] Interaction Anticorps/Antigène

Je suis pas specialiste de ces questions techniques mais c'est du a l'epitope particulier de ta proteine d'interet qui est reconnu par ton anticorps, et qui peut ne pas etre accessible, dans la bonne conformation ou ne pas posseder les modifications post-traductionelles requises pour sa reconnaissance dans certaines conditions (faut toujours garder en tete que du materiel biologique va se modifier selon la facon dont tu le process, par exemple avec certains tampons d'extractions, fixateurs ou autres, je vais pas non plus faire une liste exhaustive).  [...] Par exemple, certains anticorps pour WB vont reconnaitre une proteine que si elle est denaturee, l'inverse existe aussi. Pour l'IHC, certains vont marcher sur tissus fixes+inclus en parrafine+epitope retrieval, d'autres uniquement sur tissus frais. Encore une fois je vais pas te faire toute la liste.  [...]

[Biochimie] Purification sur colonne échangeuse d'ions

Mon sentiment est que la protéine ne s'y accroche pas. POurtant les pH des tampons ont été vérifiés ils sont bien. au pHI donc la protéine doit bien etre chargée négativement.  [...] J'ai déjà eu à étudier des interactions protéiques tellement fortes que même 1.5M NaCl n'étaient pas suffisant pour dissocier les deux protéines. Alors après tout.  [...]

[Biologie Moléculaire] Nettoyage d'ARNs & Transfert de protéines

Concernant les ARN, tu peux laisser les tampons de lavage infiltrer la colonne pendant 5-10 min avant de centrifuger (le RPE en particulier).  [...] Concernant les protéine j'ai eu un gros culot donc ça a l'air de marcher mais j'ai pas encore pu faire de quantification parce que mon kit de dosage n'est pas adapté (il interfère avec mon tampon de reprise). J'attends un kit de dosage approprié d'ici peu puis je les ferai migrer pour voir la tête qu'elles ont.  [...]

[Biologie Cellulaire] Infos protocole

Je souhaite avoir des infos sur les conditions d'immunoprecipitations à partir de culture organotypique (explants tissulaire cerveau en particulier).  [...] Si ta protéine est membranaire, il faudra vraissemblablement utiliser des tampons de lyse avec une forte quantité de détergent.  [...]

[Biochimie] Concentré une protéine recombinante

Cela peut aussi permettre de passer la protéine d'un tampon à un autre, il suffit d'éliminer une forte quantité de tampon (ne jamais faire arriver la protéine à sec) et d'ajouter à la quantité restante le tampon voulu. Avec cette méthode, la protéine reste sous forme native et soluble, contrairement aux méthodes de précipitations.  [...] Pour reconcentrer ta protéine et changer ton tampon tu peux comme il a été dit utiliser l'ultrafiltration si tu as dans ton labo le matériel nécessaire (Microcon, Centricon, Amicon, Vivaspin...).  [...]

[Biochimie] Criblage de thermostabilité des protéines par fluorescence

Dans différents tampons (pH,concentration..) j'ai effectué un test de thermostabilité de la protéine. L'utilisation d'un agent fluorescent. le SYPRO orange permet de suivre la fluorescence.  [...] Ce que je ne comprends pas. pourquoi après avoir dépasser une certaine tempéature l'intensité de fluorescence se met à diminuer Pourtant la protéine devrait etre dénaturée complétement et exposer de plus en plus ses parties hydrophobes.  [...]

[Biologie Moléculaire] difference de detection

EN FAITE AU COUR DE L'expérience notre concentration de protéine total était de 5,97 ug/ul (mesure realisé au nanotrop).ON VEUT OBTENIR DANS 15 ul 35 ug.PAR CALCUL CiVi=CfVF.ON A DEDUIT QUIL FALLAIT AJOUTER 33,5ul de nos proteine purifier et ensuite complété avec notre solution tampons de lyse pour avoir un volume final de 40 ul.  [...] on a ensuite preparé 2 TUBE DE 15 UL davec ajout de 5 ul de bleu de charge POUR FAIRE DEUX GEL.UN EST EXPOSé a la coloration coomassie et lautre pour faire le transfere.Le problème est que pour les résultats au comassie on voit rien.c'est a dire pas de bande pour notre protéine qui normalement devrait être surexprimé.  [...]

protéine inhnabituellement plus courte

Dans le premier cas oui, ça peut être une mutation. apparition d'un codon stop par substitution ou décalage du cadre de lecture (donc problème au niveau de la traduction de l'ARNm en protéine), on peut imaginer aussi un problème d'épissage (le problème arrive en amont de la traduction) par exemple.  [...] Deuxième cas. on peut aussi imaginer une mutation dans le transgène, ou bien la présence de protéases dans les tampons, ou un tampon inadapté à la protéine qui ne peut pas se conformer correctement et qui se dégrade.  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunoprécipitation

En gros, j'arrive a sortir une petite bande sur mon western-blot mais ça représente un fifrelin. J'ai essayé divers tampons de lyse mais j'évite tout de même avec détergent ionique car le but final est de mettre en évidence des partenaires de cette protéine.  [...] Je fais mes IP sur 1,5mg par échantillon (ma protéine n'étant pas trés abondante) donc environ 7 millions de celllules par puit lors du WB. Cela dit après avoir lysé mes cellules (tampon salin ou NP-40 pendant 30 min) je centrifuge le lysat et ne fait mon IP que sur le surnageant.  [...]