• Santé - Protéine, Intérêt, Tampon, Anticorps

[Biologie Moléculaire] Purification d'un serum à partir d'une membrane de nitrocellulose

Donc en gros, je fais migrer un echantillon contenant la proteine toxoplasmique P30 par SDS-PAGE puis aprés transfert, saturation et incubation avec un serum (à purifier) je coupe une portion de la membrane qui correspond a la proteine d interet et j utilise un tampon d elution pour eluer les anticorps a partir de la membrane.  [...] Une question me taraude. vous voulez purifier des Ac pour les utiliser dans une colonne d'affinité. Mais selon votre procédure utilisant une sélection sur SDS-PAGE ne risquez vous pas de sélectionner des anticorps qui ne reconnaitrons pas la structure 3D de votre protéine Ce qui risquerait de poser quelques problèmes quant au rendement de votre purif par affinité sur colonne.  [...]

Immunohisto

L'anticorps peut +/- bien marcher en western-blot par rapport a l'immunohisto (ou cyto-)-chimie. Les tampons sont differents, les conditions aussi...l'interaction epitope-site anticorps etant conditionne grandement par des interactions ioniques-electrostatiques, les tampon, pH, ions (...) jouent pas mal.  [...] Comment expliquer que mon anticorps (spécifique de l'état phosphorylé d'une protéine) se fixe sur le tissu cérébral dans une structure Y (donc il marche.), mais pas dans la structure X (y a rien du tout de marquer.) où l'on observe du marquage en western avec le même anticorps.  [...]

[Biologie Cellulaire] Co-Immunoprécipitation

5. Tu rajoutes un tampon dénaturant (SDS et b-mercaptoethanol), qui va dissocier et dénaturer les anticorps, libérant ainsi les protéines A et B.  [...] Tu peux aussi immunoprécipiter avec un anticorps anti C (autre protéine connu pour ne pas interagir avec A ni B), et vérifier la présence de A ou B. Si tu détectes A ou B, cela signifie que tu as une fixation aspecifique de ta protéine sur les billes, que tes lavages n'étaient pas bons.  [...]

[Biochimie] Concentré une protéine recombinante

J' ai fait plusieures purifs d'une protéine recombinante de 7 kDa. Elle se trouve dans un tampon Imidazole 500 mM. Je voudrai maintenant la concentré et la passer dans un tampon 50 mM phosphate. Question. est il possible de faire d'une pierre, deux coups et Quels sont le méthodes éfficaces pour concentré et /ou changer le tampon d'une protéine de 7 kDa.  [...] Cela peut aussi permettre de passer la protéine d'un tampon à un autre, il suffit d'éliminer une forte quantité de tampon (ne jamais faire arriver la protéine à sec) et d'ajouter à la quantité restante le tampon voulu. Avec cette méthode, la protéine reste sous forme native et soluble, contrairement aux méthodes de précipitations.  [...]

[Biochimie] Tampon de purification, NaCl et KCl

La protéine étant plus stable dans le PO4 (que dans le Tris), je suis passé à un tampon K2HPO4 / KH2PO4. Pour éviter d'introduire trop d'ions différents, je voudrais utiliser du KCl à la place du NaCl. Je constate que dans la littérature, il est fréquent que celui-ci soit utilisé à des concentrations moindres, mais je ne trouve la raison nulle part.  [...] Ma question est donc. pourquoi la concentration de KCl dans un tampon est toujours plus faible que le NaCl Le KCl stabiliserait la protéine plus efficacement, et éviterait les interactions non spécifiques à concentration plus basse.  [...]

[Biochimie] tampon de lyse

Qu'est ce qui te fait dire que tes protéines d'intérêt ne sont pas solubilisées par le tampon de lyse Les protéines que tu regardes sont-elles membranaires, localisées dans un sous-compartiment cellulaire particulier, les surexprimes-tu Comment lyses-tu tes cellules (composition tampon, étapes physiques de lyse (choc thermique, piston Dounce, vortex, sonication,...)).  [...] j'ai lysé mes cellules par un tampon de Karla au Bertin,le tampon renferme dees antiprotéase,PMSF,NAF,EAU,Napp.Je cherche aussi bien des protéines membranaire et du stress oxydative certaine sont cytosolique,c'est bisard j'ai fais un dosage BCA j'ai des concentrations trés faible en protéine entre é 2 et 5 mg/ml mais c'est jouable pour déposer en faisant l'éléctrophorése à la fin du transfert j'ai révéler au ponceau il n'ya pas eu de transfert sur ma membrane et effectivement à la révalation d'une protéine j'ai rien vu au chémidoc alors que les marqueurs ont transférer.  [...]

[Génétique] Adn

voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une menbrane pour un test de type western. sachant ke la formulation de ce tampn est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( ja i reponde a la kestion) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...] voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une membrane pour un test de type western. sachant que la formulation de ce tampon est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( j'ai deja repondu a cette question) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...]

[Biochimie] Casser des aggrégats

Mes cellules surexpriment en effet ma protéine, je travaille sur des cellules BHK et j'utilise le tampon RIPA comme tampon de lyse.  [...] D'habitude, une fois le tampon de Laemmli ajouté, je dénature 1h à T° ambiante pour cette protéine. Et les résultats en western sont très satisfaisants, une belle bande.  [...]

Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

La sérine aurait une possibilité d'intéragir au niveau structurel avec un autre aa de ta séquence malgrè la présence de dénaturant Même si au moment de l'injecté elle est dénaturé, le fait que le tampon de migration dilue le composée dénaturant et imaginant que ta protéine a une vitesse de reconformation 3D rapide, alors il est possible que.  [...] Il ne devrait pas y avoir de renaturation de la protéine durant la migration puisque normalement noirdez a coulé des gels contenant du SDS pour migrer en condition dénaturante, et le tampon de migration contient une quantité élevée de SDS. La seule renaturation qui peut avoir lieu est, a priori, durant le transfert car on dissocie le SDS de la protéine.  [...]

dégradation de protéine recombinante

La seule chose que je peux dire c'est que lorsque je fais un immunoblot avec un anticorps anti-histidine je n'observe que ma protéine d'intérêt mais cela n'exclue pas que la protéine ait perdu son étiquette histidine lors de sa dégradation et que les bandes observées par coloration au nitrate d'argent ne soient pas ds formes de dégradation.  [...] Si tu fais une gel filtration, c'est simple, tu concentres ta protéine autant que tu peux (dans un volume inférieur à 100 µl de preference). Tu fais ensuite circuler dans la colonne ton tampon A, tu injectes la protéine et les protéines se séparent toutes seules en fonction de la taille (les plus grosses d'abord, les plus petites après), il n'y a plus qu'a recuperer les fractions et trouver dans lesquelles se trouve la protéine.  [...]