• Santé - Mutations, Plasmide, Séquences

[Biologie Moléculaire] Faux positif en mutagénèse dirigé

Je réalise une mutagènese sur un plasmide plenti afin de modifié 3 bases qui ont 1 à 2 bases d'écart en 1 mutagénèse. Après transformation j'ai plein de colonies. Problème en les séquençant mes mutations n'ont pas disparu.  [...] (digéré plus longtemps par dpn1ou quantité plus élevé pour d'autres mutagenese sur le même plasmide cela a très bien marché avec les conditions standart).  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

oui c'est un peu court. Mais pour ce genre de technique tu dois utiliser des amorces contenant la séquence que tu veux modifier, mais aussi une séquence commune avec ta matrice d'ADN. Comme ca l'amorce s'hybride partiellement avec ton ADN, et le reste contient ta mutation.  [...] Dans un premier temps tu dois insérer ta séquence à modifier dans un plasmide. La Pfu turbo est une polymérase qui fait moins d'erreurs que la Taq. Par PCR, tes amorces contenant les mutations désirées vont être allongées, tu obtiendras ainsi des plasmides linéarisés, pareils au plasmide parental mais contenant tes mutations.  [...]

[Biologie Cellulaire] Transformation levure par PCR

Je travail sur les levure et je souhaite les transformer afin qu'elles expriment ma protéine d'intérêt couplée à une protéine fluorescente. Pour cela j'utilise la technique. PCR based transformation method qui consiste à utiliser un plasmide (pRS306) qui contient la protéine fluo et faire une PCR avec des oligonucléotides codants pour les séquences de mon gènes que je veux marquer.  [...] Je comprend la théorie mais techniquement je ne vois pas du tout comment cela se produit, comment mon plasmide intègre mes séquences codantes Est ce que il faut digérer mon plasmide avant si vous avez des publi ou des revues qui explique ca en détail je vous en serais très reconnaissant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage Gateway...intérêt ?

- un premier intérêt est celui que tu dis. tu n'utilises pas d'enzymes, pas besoin de choisir 2 enzymes différentes, de déphosphoryler le plasmide, phosphoryler les primers...ect... une simple PCR suffit pour l'obtention de ton gène avec les séquences nécessaires à l'introduction dans le plasmide.  [...] Pour l'intérêt de tes 2 plasmides. générallement, ton second vecteur est un vecteur d'expression et non le premier vecteur...le premier vecteur te permet par exemple de séquencer le gène introduit...même si par précaution certains séquencent aussi après insertion dans le second vecteur (comme dit avant, les deux séquences sont censées être identique car pas de polymérase intervenant, il y a uniquement une recombinaison...).  [...]

[Microbiologie] Plasmides

Dans ce cas si je me rappelle, tu aurais trois types de transposition. Les rétrotransposons de type rétrovirus, les rétrotransposons non-viraux et les transposons de type copier coller.   [...] Si ton plasmide contient une transposase adaptée à l'organisme, et une séquence flanquée des séquences qu'elle reconnait, alors il peut y avoir transposition. Je construis des plasmides de ce type pour mon travail de thèse et intégrer des séquences dans le génome de mon organisme modèle.  [...]

[Biochimie] Séquence Kozak

j'ai reçu des plasmides contenant des protéines couplées en N term à une protéine fluorescente. Dans certains plasmides il y a deux séquences kozak et dans d'autres non.  [...] Ta sequence sert a l initiation de la traduction. En theorie tu dois avoir ces sequences comprises dans les promoteur au sein de tes plasmides. Certaines personnes preferent en rajouter au cas ou.  [...]

[Biologie Moléculaire] Primers

Les primers peuvent aussi être crées de manières à ajouter des séquences de restrictions de chaque coté de la séquence amplifiée, lui permettant de l'introduire par après dans un plasmide.  [...] Une fois dans un plasmide, d'autres primers peuvent être utilisés pour induire une mutation précise dans la séquence amplifiée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de séquençage

Ce que tu séquences c'est bien le plasmide Parce que je ne comprends pas survenue de structure secondaire dans de l'ADN double brin.  [...] Oui enfin un partie d'un plasmide, mais lorsque tu le séquences tu le dénatures pour permettre l'hybridation de ton amorce, il est alors sous forme simple brin ton ADN (au moins sur une partie) et c'est a ce moment la que la structure doit se former.  [...]

Manipulations génétiques

Pour intégrer un gène d'intéret dans un génome, c'est assez compliqué, je me ferai un plaisir de t'expliquer si tu connais les notions de PCR, séquences nucléotidiques complémentaires, arn polymérase, plasmide, vecteur, recombinaison homologue ^^.  [...] je me ferai un plaisir de t'expliquer si tu connais les notions de PCR, séquences nucléotidiques complémentaires, arn polymérase, plasmide, vecteur, recombinaison homologue ^^.  [...]

[Biologie Moléculaire] promoteur sequence regulatrice et activité CAT

mon exo consiste en la transfection de cellules utérines par un plasmide contenant un gène CAT,un promoteur eucaryote et des séquences cis régulatrices en amont du promoteur.  [...] C'est l'effet de l'E2 ou de la progesterone sur l'expression du promoteur qui est étudié. L'interaction de E2 ou de la progesterone sur les séquences régulatrices cis peut entrainer une modification de l'expression du promoteur et donc de l'activité CAT (comme dans le cas de l'estradiol).  [...]