• Santé - Méthode, Tube, ADN

Le séquençage de l'ADN pour les nuls !

Le remplacement du marquage radioactif par des fluorochromes aujourd'hui couramment utilisés, permet de réaliser les quatre réactions dans le même tube. La méthode est limitée au séquençage d'un millier de nucléotides consécutifs, à cause de la faible processivité de l'ADN polymérase qui se détache au cours de la synthèse.  [...] Cette dernière méthode permet de séquencer individuellement chaque molécule d'ADN. Les brins complémentaires de morceaux d'ADN très courts attachés sur une surface sont tour à tour additionnés d'un seul nucléotide fluorescent. À chaque cycle, la localisation de la fluorescence provenant des brins est enregistrée par des caméras, permettant ainsi de suivre au fil des cycles la séquence de tous les brins.  [...]

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Clairement cette méthode artisanale ne permet pas d'obtenir de l'ADN pur même avec une centrifugeuse, puisque l'ADN est déjà précipité, il ira se mettre au fond du tube avec les débris cellulaire. En fait pour ne conserver que l'ADN, il faut centrifuger le mélange avant d'ajouter l'alcool afin d'éliminer les débris de cellules, puis récupérer le surnageant et faire précipiter l'ADN.  [...] Mais une personne, à qui on ne montre que le résultat de l'électrophorèse, pourra déduire que l'ADN du tube A est aussi présent dans le tube Z de même que le sont aussi ceux des tubes B,C,D,E non.  [...]

[Biochimie] Séquençage de ddN

c'est plutôt simple si on comprend la méthode de Sanger. L'incorporation de didésoxynucléotides (ddN) arrête la synthèse d'ADN. Habituellement, comment se déplace l'ADN sur un gel d'électrophorèse (n'oubliez pas que l'ADN est chargé négativement en raison des nombreux groupements phosphates) Sachant cela et le principe de base de l'électrophorèse, on peut savoir quel brin est le plus long et lequel est le plus court.  [...] pour la méthode de Sanger dans un tube on ajoute l'ADN à séquencer, UNE amorce, la polymérase, des dNTP et des ddNTP, on lance la réaction de séquence (semblable à la PCR). Ici c'est l'ancienne façon de faire (l'originale). On met la même chose dans le tube mais un ddNTP différents dans chaque tube donc au final un tube avec ddNTP A, T, C, G.  [...]

[Biologie Moléculaire] les résultats de migration sur gel d'agarose

pour les bondes voyez s'il vous plait maintenant après la résolution ( nous avons utilisé pour la capture smartgel V7.1, je ne maitrise pas encore la méthode de capture, je suis entrain de l'apprendre).  [...] Autres questions s'il vous plait comment calculer le volume de la BET à ajouter dans le gèle d'agarose à 1%(je veux la relation générale s'il vous plait ), sachant que les informations notées sur le tube de stock sont les suivants. 10 ml (10Mg/ml) (Invitrogen) et quelle la méthode la plus pratique est ce que j'ajoute le BET directement dans le gel ou après la migration et la coloration(après la migration sur gèle),et comment calculer le volume du bleu de bromophénol (le colorant) à ajouter pour suivre la migration de l'échantillon de l'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] pb migration ADNg sur gel

L'extraction se fait à l'aide du TriReagent. Pour le dosage (20µL d'ADN + 980µL d'eau stérile dans la cuve du spectro), j'obtiens des valeurs de DO de 0,105 pour prendre l'exemple sur un tube. Ce qui me donne une concentration de 262,5 µg/mL d'ADN. Or je dépose ensuite dans le puit d'un gel d'agarose 0,8% environ 10µL d'ADN+4µL de bleu de charge.  [...] En ce qui concerne les ARN, dans le labo où je suis on prend mille et une précautions pour arriver à les isoler...(utiliser des tubes et cones stériles, traités à l'eau DEPC puis rincés à l'éthanol puis encore à l'eau, ou un kit de purif d'ARN utilisant du mercaptoéthanol pour inactiver les RNases), précautions que je ne prends pas pour l'ADNg, je pense qu'il y a peu de chances que j'isole de l'ARN total et que ce soit cela que je dose.  [...]

[Biologie végétale] pcr : LP/RP et LB/RP pour une plante

alors pourquoi on n'obtient pas de signal de LP/RP sur un gel pour une plante aa car apres une extraction d' ADN. dans le tube j'ai toute l'adn de la plante cad j'ai les séquences que vont tricoter les LP/RP et aussi les séquences pour LB/RP.  [...] Alors je crois que tu t'es emmêlé les pinceaux, tu viens de dire je comprend pas le fait que LP/RP ne peut pas se lier a l'ADN normal alors que justement, tu nous as présenté ce couple d'amorces comme celui qui peut se fixer et donc permettre l'amplification du gène normal.  [...]

[Biologie Moléculaire] Connaitre séquence génomique....

Tu amplifies ton ADNg une premiere fois, puis tu refais une pcr nichee sur ton produit pcr en utilisant l'oligo specifique de ton fragment d'ADN + l'oligo specifique de ton oligo degenere... Je ne sais pas si je suis tres clair... Un labo voisin de mon labo de these utilisait cette methode pour sequencer de l'ADN inconnu.  [...] Dans chaque tube à essai, on met en présence de l'ADN, l'enzyme, l'amorce, tp et Mg2+, dNTP...les ddNTP... et donc dans chaque tube, par exemple le tube A. dés qu'on trouve la base A ça s'arrête... donc on est censé trouvé dans notre tube deux fragments puisqu'il est coupé au niveau de la base A.  [...]

[Divers] Vivant??

En revanche, si vous mettez de l'ADN dans un tube, il ne se passe rien. L'ADN ne peut pas se répliquer seul. Ceci fait que l'ADN n'est pas vivant.  [...] Je ne crois pas que la réponse soit assez simple. Les bactéries sans un environnement favorable ne se reproduiront pas. tout comme l'ADN seul dans le tube a essaie sera inerte.  [...]

Traitements des données en QPCR

Dans une première manip, je vais faire deux courbes standart (une pour le gène de référence et une pour le gène d'intérêt) et je vais mettre tous mes échantillons (ADN immunoprécipité, plus le tube sans anticorps ) avec chacun des deux couples de primers.  [...] Quelqu'un dans mon labo m'a dit de comparer les valeurs quantité d'ADN immunoprécipité sur quantité d'ADN non spécifique dans le tube sans anticorps (Ac/sans Ac) et de calculer des barres d'erreur là dessus. Par contre, cette personne ne normalisait pas par rapport au gène de référence.  [...]

Calcul d'un concentration de départ d'ADN à partir de l'absorbance de la solution diluée.

Afin de déterminer la concentration d'une solution d'ADN, vous préparez un tube contenant. 3µl de cette solution d'ADN et 97µl d'H2O.  [...] La correction dans le bouquin me donne comme résultat. 9,5g/L d'ADN double brin, c'est bien ça (Sachant que je trouve plutôt 0,095g/L).  [...]