• Santé - Fragment, ADN, Plasmide

plasmide-clonage

Ton gène ou fragment d'ADN que tu désires cloner est inséré dans le plasmide grace à un polylinker qui coupe le gène de la bétagalactosidase (bgz).  [...] Que la bactérie pousse veut dire qu'elle a reçu le plasmide (contenant le gène de résistance à l'antibiotique), pas forcément le plasmide avec le fragment d'ADN qui t'interesse dedans. Il faut alors vérifier.  [...]

clonage/enzyme en dehors du site multiple de clonage

Bonjour à tous, je vous sollicite pour une petite question. Lors d'un TP, j'ai inséré un fragment d'ADN dans un plasmide et derrière, pour vérifier la ligation, j'ai digéré le plasmide avec les 2 enzymes de restriction utilisé à la base et après migration sur gel il se trouve que au lieu d'avoir 2 fragments attendus (un fragment correspondant à mon plasmide et un fragment correspondant à mon insert) je n'ai qu'une seule bande.  [...] Il se peut que ton MCS ait été enlevé au cours du clonage (c'est normalement peu probable si tu as bien designé ton clonage). Il se peut également que le plasmide de départ soit muté et ne possède pas certains sites de restriction (également assez peu probable).  [...]

[Biologie Moléculaire] Quelques questions ??

3-si par exemple on coupe un plasmide par Bamh1 et on insere une sequence d'adn. Comment peut on verifier la presence de ce fragment ajoute dans le plasmide.  [...] Le vecteur d'expression contient en plus de la séquence de résistance et du site de multi-clonage et du site d'origine, il contient en plus un promoteur.   [...]

[Biologie Moléculaire] Preparation d'une gamme étalon ou standard pour PCRq

relier ton Ct aux Ct d'ADN de concentration connu je ne suis pas sur que cela puisse se faire puisque x ng ou x nmol ne représente pas une quantité de transcrit (selon la taille des fragments), en plus de ca, dans les quantifications, les nucléotides libres sont aussi pris en compte, les primers aussi.  [...] Donc meme si tu as une séquence de ton gène en plasmide, que tu l'amplifie dans des bactéries, que tu l'extrait des bactéries, pose sur gel puis extrait du gel ta bande d'intéret, la purifie puis quantifie, tu auras la concentration que tu pourras diluer et te servir en qPCR, mais la meme quantité de transcrits, sur de l'environnemental ne donnera pas les mêmes résultats (ou alors il ne faut pas que tu utilise des primers dégénérés sur ton témoin car pour une meme quantité de primers tu n'auras pas le même taux de fixation, mais même dans ce cas, ton efficacité E ne sera pas la meme entre ton standard et ton echantillon).  [...]

[bio mol] Séquencage. RFLP

1/ Dans la méthode de sanger on insert un fragment d'adn mono brin dans un plasmide. dans ce cas la le plasmide est alors monobrin.  [...] Quand le séquencage est en shotgun (séquencage de génomes), une banque d'ADN (ADNc) issue de la digestion statistique de ce fragment est clonée dans un plasmide, un BAC ou un YAC. Des molécules de plasmides (BAC,...) intègrent.  [...]

[Biologie Moléculaire] Bandes d'ADN non amplifié??

J'ai effectué une PCR certaines amorces ont été révélées incompatibles chez certaines souches, cependant seul quelques souches montrent après analyse sur gel des amplifiats des bandes correspondant à l'ADN (vérifié par la taille correspondant à celle de l'ADN mis au départ), ma question est pourquoi cette bandes n'apparait pas chez les autres souches.  [...] La réponse la plus simple est que ces souches n'ont pas le fragment d'ADN que tu essaies d'amplifier. Quelle type de molécule supporte ce fragment (chromosome, plasmide) Est-ce une PCR colonie ou sur une extraction Il peut aussi s'agir de la présence d'inhibiteurs de PCR dans les extractions d'ADN des souches qui semblent négatives.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Nous avons fait une clonage d'un ADNc dans un plasmide... En parallèle, nous avons fait un contrôle négatif qui contenait le vecteur mais sans insert (l'insert étant remplacé par de l'eau distillée). J'aimerais savoir à quoi sert exactement le contrôle négatif.  [...] Pour l'instant, nous n'avons aucun moyen de contrôler que nos colonies aient bien pris le vecteur + l'insert. C'est un tp en plusieurs séances, le tp de lundi prochain a pour but de vérifier le clonage en purifiant les ADN plasmidiques puis on fera des digestions enzymatiques contrôles.  [...]

[Biologie Moléculaire] vecteur

On récupère les bactéries par centrifugation. Puis, on perméabilise la paroi bactérienne par un traitement doux permettant d'obtenir un passage en solution des plasmides qui sont plus légers que l'ADN bactérien. La purification des plasmides peut être ensuite réalisée par chromatographie liquide à haute performance ou ultra-centrifugation en gradient de densité.  [...] Pour maintenir la linéarisation, il est indispensable de traiter le plasmide linéaire par une phosphatase alcaline qui enlève les groupements phosphates en 5'. Le plasmide linéarisé et traité par une phosphatase alcaline est ajouté au fragment d'ADN à insérer en présence d'une ligase.  [...]

[Biotechnologie] Clonage???

Comment feriez-vous pour cloner un fragment d'ADN linéarisé par ECOR1(G/AATTC) dans un plasmide ouvert par PVU2(GAG/CTC).  [...] L'ajout de polylinker pour PVU2 à l'ADN avec le T4 (pour avoir des extrémité franches).  [...]

[Microbiologie] clonage

je dois cloner un fragment d'ADN dans un plasmide pbluescript, j'ai digéré le vecteur par ECO RI je dois effectué une déphosphorylation afin d'éviter la recircularisation de plasmide, comment je peux m'assurer que la déphosphorylation a été faite avec succès après l'avoir traité par la phosphatase alcaline.  [...]