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Plasmide

J'ai préparé des plasmides que j'ai inséré dans des cellules d'E.coli compétentes et ensuite je les extrait avec le kit Wizard Plus SV pour analyser le plasmide qui a été introduit dans les cellules(je ne comprends pas l'interet car normalement je sais ce que j'ai introduit alors pourquoi je les extrait).  [...] La selection des plasmides recircularisés se fait lors de la transformation de cellules électrocompétentes. Seules les cellules ayant reçu un plasmide recircularisé pourront croitre sur le milieu sélectif car seulement ces plasmides peuvent coder pour le gène de résistance en question (la sélection doit se faire sur Ampicilline je suppose ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Hydrolyse ADN

Je cherche à hydrolyser de l'ADN extrait de cellules cutanées humaines en nucléoside monoP. Je sais qu'il faut que je fasse un hydrolyse enzymatique mais je n'ai pas trouvé avec quelle enzyme...un un kit ferait encore mieux l'affaire.  [...] une méthode enzymatique ne te donnera que des polynucléotides je pense. La méthode HCl sépare les bases, les sucres et tout.   [...]

[Biologie Moléculaire] RT-PCR à partir d'ARNtot possible ?

Dans mon labo (où je ne suis qu'une stagiaire M2) on extrait les ARN sur colonne avec les kit quiagen. kit mini pour moins de 10 millions de cellules et kit micro en dessous de 500 000 cellules. Ca marche bien. je fais des PCR quantitatives à partir de l'ARN de 160 cellules de souris.  [...] Si tu veux tester la qualité de tes ARN il faut trouver un labo ou ils ont des machines Agilent. on dépose 9 échantillons sur une puce qui resseble à une microplaque et on lance la machine magique qui recrée un gel virtuel par ordinateur. On peut avoir des beaux résultats pour 500 cellules seulement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

La premiere est de verifier que tes cellules sont competantes (transformation d'un plasmide circulaire connus ~ 50 ng, genre pUC, pBR, etc).  [...] Normalement dans le kit tu devrais avoir un plasmide controle a transformer. Il faut vraiment que tu verifies tes cellules, ca arrive tres souvent.  [...]

[Biologie Moléculaire] Difficulté d'interprétation de gel d'électrophorèse

- pour les digérés. la bande en plus peut s'expliquer par le fait la digestion n'a pas été complète et qu'il reste des plasmides à l'état superenroulé.  [...] - pour les non digérés. ça marche pas vraiment car si la bande à 4000 est l'état superenroulé alors il devrait être majoritaire et ça voudrait dire que le plasmide linéaire migre au même endroit que le plasmide circulaire ouvert.  [...]

extraction de gel

Le concept est tres simple dans ton tube ou tu récolte ton plasmide il peut y avoir plusieurs longueur d'ADN (ton plasmide avec insert, mais pourquoi pas ton plasmide vide, ou autre...) ducoup tu dois séléctionner uniquement ce qui t'interesse, tu les sépare donc par electrophorèse sur gel, et ensuite puisque tu visualise ou se trouve ton ADN sur ton gel, il suffit d'extraire (physiquement, avec une lame de rasoir par exemple)le petit carré ou se trouve la bande d'ADN qui t'interesse, ensuite le gel va etre fondu et purifié afin de retirer l'agarose et ne récupérer que l'ADN.  [...] oui j ai lu le protocole du kit et tout mais se que je veux savoir c est l utilite de re extraire le plasmide sur gel comme on la extre et digere deja.  [...]

[Biologie Moléculaire] pb dosage ARNtotal spectro

Pensez-vous aussi que je doive utiliser un autre kit pour mes extractions (oui parce que je dois faire suite au stagiaire de l'année dernière, donc utiliser ce kit...mais il est fait pour cellules et tissus de mammifère, or je travaille sur les champignons...celà me laisse perplexe).  [...] Et au niveau du kit utilisé, ne pensez vous pas que le fait qu'il soit fait pour cellules et tissus de mammifères peut faire diminuer la quantité d'ARNtotal que j'obtiens à la fin.  [...]

[Biologie Moléculaire] Electrophorèse en gel d'agarose pGFP

J'ai réalisé sur un plasmide pGFP une extraction classique puis un traitement à la Rnase et parallèlement une digestion avec BamHI.  [...] ça peut arriver si le plasmide circulaire est superenroulé. Dans ce cas, il a une taille apparente inférieure au plasmide linéaire.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème quantité d'adn plasmidique après extraction

Je viens vous trouver car j'ai un petit doute quand à une extraction d'adn plasmidique. Habituellement j'utilise des kit qiagen (miniprep) et j'obtiens environ 100ng/µl de plasmide.  [...] Sinon la prep est pour une transfection donc il faudrait qu'elle soit pure, avez vous des protocoles pour obtenir un plasmide plus pur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transfert de résistance

Si je prends une population de souches résistante, j'en ai à peut près la moitié qui présentent un plasmide a l'électrophorèse (après extraction avec un kit traditionnel). Et je veux savoir si la souche est capable de transférer son plasmide à une souche sensible et la rendre résistante.  [...] Je me dit soit le plasmide n'à rien à voir avec la résistance (mais j'en revient au 1er problème, comment mon transconjugant est devenu résistant), soit le plasmide n'est pas exprimer correctement par ma souche, soit il est létale. Le problème ici c'est que je ne sait pas comment aller plus loin.  [...]