• Santé - Extraction, Protéine, Cerveau, IP

[Biochimie] Extraction protéine de cerveau pour IP

je souhaiterai faire une IP d'une protéine en fusion avec MBP et des extraits protéiques de cerveau de souris.  [...] Je souhaiterai savoir si vous auriez un protocole d'extraction de protéines à partir de cerveau.  [...]

[Biologie Cellulaire] Infos protocole

- les conditions d'IP dépendent de la protéine à immunoprécipiter. sa localisation (membranaire, cytosolique, nucléaire) conditionne le type d'extraction protéique à effectuer, de son abondance va dépendre la quantité de lysat à utiliser.  [...] la proteine est la nitric oxide synthase phosphorylée elle doit etre memnbranaire et peut etre cytosolique je l' extrai d'une tranche de cerveau de 250micrometre elle est donc en tres petite quantitée.  [...]

[Biologie Cellulaire] poly-ADP-ribosylation de protéines

Merci pour ta réponse. C'est sans doute une bonne idée mais notre labo n'est pas habilité pour la manipulation de radioactivité. Est ce qu'en inhibant les PARP, je peux induire un changement de poids moléculaire de ma protéine Ce serait déjà une indication.  [...] Comment souhaites-tu inhiber les PARP Inhibiteur ou siRNA Dans ce cas, une condition sans inhibiteur/siRNA et une avec inhibiteur/siRNA avec IP anti-ta protéine et western blot anti-PAR et la démonstration sera correcte, je trouve, au niveau fonctionnel. Peut-être que dans les publications cela leur suffit comme manip, mais il serait plus rassurant d'ajouter un marquage métabolique et/ou une spectrométrie de masse dans la mesure du possible (collaboration avec une plate-forme ou un labo intéressé...).  [...]

[Biologie Cellulaire] Manip de co-IP??? what's wrong!!!

Il y a autre chose qui pourrait expliquer le problème. satures-tu tes billes protéine G sépharose avec de la BSA Certaines protéines se fixent sur la sépharose et/ou sur les protéines G. Une étape de saturation peut donc s'avérer nécessaire pour masquer les sites potentiels d'interaction non spécifique.  [...] En fait, je crois qu'on peut incriminer tout (l'Ac, les billes le tag...), je voudrais juste attirer votre attention à un détail. C'est que j'ai réalisé dernièrement deux manip d'IP anti V5, la première avec la protéine A j'avais un lysat cellulaire totale (non transfecté par V5) et un autre transfecté V5, la deuxième manip d'IP réalisée avec la protéine G, idem.  [...]

Technique

dans le GST, il faut un tag GST, donc une protéine de fusion. Dans l'IP, pas besoin de protéine de fusion, on peut le faire sur une protéine native, mais il faut un anticorps spécifique.  [...] De la, on peut dire que le GST est universel mais nécessite de faire une protéine de fusion, alors que l'IP on peut la faire en conditions physiologiques, mais il faut un anticorps spécifique qui fonctionne. etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunoprécipitation

Pour voir si l'étape d'incubation avec les billes de protéine A-Sépharose est efficace, après avoir incuber vos extraits et centrifuger, vous pouvez réaliser un WB sur les billes comme vous le faites actuellement, et en plus un WB sur le surnageant. Le WB sur le surnageant sera donc représentatif des protéines qui ne se sont pas liées aux billes.  [...] La protéine d'intérêt est-elle taggée L'anticorps utilisé pour l'IP est -il dirigé contre une étiquette Avez-vous essayé un WB sur le culot de billes après IP en procédant à une étape de dénaturation pour être sûr de dissocier la protéine des billes (parfois des anticorps se lie très fortement, dans ce cas il faut peut-être changer d'anticorps pour rester dans des conditions natives, ou alors tester avec des concentrations salines plus importantes).  [...]

[Biochimie] bandes parasites aprés révélation western-blot

j'aimerais savoir si quelqu'un à l'habitude de réaliser des immunoprécipitations avec révélation de la protéine d'intérêt en western blot.  [...] mon éluat final d'IP contient l'Ac que j'ai utilisé pour réaliser mon IP et bien sur ma protéine d'intérêt, je réalise ensuite un SDSpage et un western sur la nuit, je révèle mon blot à l'aide de l'Ac que j'ai utilisé pour mon IP ainsi qu'avec un Ac-HRP dirigé contre mon Ac d'IP, je bloque la membrane avec lait écrémé 3%.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot : quelle unité ?

Je le regarderais plus tard. Malgré que ce western ne soit pas beau, il est tout de même interprétable. la protéine est ubiquitinée au bout de 20 minutes et cette ubiquitination perdure au cours du temps, ce qui veut dire, si ces temps sont sur cellules, que l'ubiquitination en question n'est pas de type à adresser au protéasome (K48) et que l'ubiquitination est stable (non réversée par des déubiquitinases).  [...] 200 kDa ce n'est pas non plus énorme en western blot. J'ai travaillé un an sur une protéine de 250 kDa avec un bon anticorps les westerns étaient jolis avec un protocole standard. Je pense que ce problème de smear lors des ubiquitination assay viennent de l'ubiquitination qui peut être une mono-, multi- ou polyubiquitination.  [...]

[Biochimie] Etude des partenaires protéiques : Co-Immunoprécipitation, Tap-Tag et double hybride

Pour l'IP, ça dépend des protéines il n'y a pas de règle absolue, mais il est vrai qu'n monoclonal peut masquer un potentiel site d'interaction avec une autre protéine.  [...] tap-tag. c'est de l'in vivo aussi, y a pas le problème des anticorps comme l'IP, et c'est bien pur grâce à l'utilisation de deux colonnes justement, mais après c'est fait avec une protéine de fusion donc ça peut aussi changer l'interaction.  [...]

[Immunologie] immunoprécipitation

L'immunoprécipitation est une technique biochimique permettant de mettre en évidence une intéraction physique entre 2 protéines. On effectue d'abord une IP avec une résine permettant de purifier uniquement une protéine et ensuite on révèle par western la seconde protéine qui, si elle est présente, démontre bien que les 2 protéines étaient liées car l'IP ne sélectionne que la première protéine ou la première protéine plus celles qui sont liées à elles de manière covalente.  [...] Ben non car il y a toujours une part d'aspecifique dans ces reactions. donc tu vas avoir plus ou moins de proteines contaminantes qui vont etre purifiées avec ta proteine d'interet. Le SDS-PAGE te permet de verifier que la taille de la proteine immunoprecipité est bien la bonne.  [...]