• Santé - étape, Lavage, ARN

RT PCR quantitative

Dans les 2 cas, je te conseille de préparer soigneusement des ARN ADN-free = après extraction de tes ARN, tu les traites à la DNase. J'utilisais le kit RNeasy de Qiagen (colones) en faisant le traitement à la DNAse (Qiagen) directement sur la colonne pendant l'étape de lavage des ARN.  [...] Comme ça la DNase est eliminée au lavage. Après l'élution tu as des ARN tous propres, sans DNase (problématique pour l'étape de PCR suivante.) et sans ADN génomique qui te donnerait des résultats faussement positifs et sur-estimés.  [...]

real time pcr

donc maintenant j ai mes oligos (j espere que ca marchera)mais j ai un autre problème, j ai extrait mes ARN avec la methode du phénol chaud, est ce que ca pose des problemes pour une real time pcr ou l etape de reverse transcription si oui quel kit dois je utiliser pour purifier.  [...] J'utilise le kit RNeasy de Qiagen (colones) en faisant le traitement à la DNAse (Qiagen) directement sur la colonne pendant l'étape de lavage des ARN. Comme ça la DNase est eliminée au lavage. Après l'élution tu as des ARN tous propres, sans DNase (problématique pour l'étape de PCR suivante.  [...]

[Biologie Moléculaire] extraction faible qté ARN

Enfin pour diminuer ma contamination au phénol (et oui malgrès l'utilisation d'une colonne silice), je souhaite faire un ou des lavages préalables supplémentaires au chloroforme mais cela ne risque -il pas de diminuer encore mon rendement.  [...] Vu mon faible rendement en ARN et en qPCR j'essaie d'optimiser en jouant (peut être) sur les incubations dans le tampon de lyse, l'utilisation de carrier (sachant que ce dernier est susceptible d'être à l'origine de signaux non spé lors de la PCR d'après certains articles) et sur les étapes de lavage.  [...]

[Biologie Moléculaire] ARN insoluble ??

les ARN de cellules non transfectées se resuspendent bien. Le problème c'est que pour transformer des hépatocytes, c'est la seule solution. Mais le PEI a été évacué en changeant le milieu, et il y a eu un lavage avant extraction.  [...] absolument. Je n'arrive pas a concevoir qu'un élément présent lors de la transfection, meme apres changement du milieu et lavage, persiste au point d'empecher les ARN de se remettre en solution.  [...]

consommation d'oeufs périmés

parceque les oeufs que nous consommons régulièrement et acheter en supermarché on subit différentes étapes avant leur conditionnement dont une étape de LAVAGE, ce qui finalement n'est pas top car supprime ce film. Donc une barrière en moins pour les bactéries.  [...] Le moindre lavage est strictement interdit en France. De même que n'importe quel brossage de l'oeuf. Mouiller la coquille la rend poreuse, et comme l'oeuf est un milieu de culture quasi idéal, on comprend le pourquoi de cette interdiction.  [...]

[Biochimie] Destruction des ponts disulfure

Je cherche à détruire (ou oxyder) les ponts disulfure d'un mélange de protéine, et ce d'une façon que je puisse ensuite ajouter ma sonde fluorescente qui reconnait les thiols (extrémité S-H). Et pour compliquer les choses un peu plus, je ne peux pas avoir plus de 2 étapes, ne peut pas chauffer au delà de 50-60°C, et je préférerai que ma sonde fluorescente reste fluorescente. Oui, un vrai challenge.  [...] Pourquoi ne pas utiliser le DTT dans une première étape, en effectuant ensuite un lavage (dialyse par exemple) pour éliminer le DTT excédentaire et n'ajouter qu'ensuite votre sonde lors d'une deuxième étape.  [...]

[Biologie Cellulaire] Mesure de l'activité d'exocytose de la HRP chez l'amibe (Niveau L2)

Ton protocole est tout à fait juste. Peut-être une petite étape de lavage à 4°C avant de les suspendres dans ton tampon d'exocytose afin d'éliminer des HRP qui serait associées de manière non spécifique aux cellules. (Et à 4°C pour bloquer l'exocytose afin de ne pas démarrer l'exocytose avant le lavage).  [...] J'ai pensé au dosage du calcium parce que l'exocytose est parfois associé à la variation de la concentration du calcium au niveau synaptique par exemple mais c'est peut être un raccourci et une fausse route dans le cas de l'amibe.   [...]

Extraction ARN totaux

Personellement, j'utilise les kit QIAGEN pour effectuer mes extractions. Cette méthode consiste à capturer les ARN totaux sur une colonne et de la nettoyer par la suite. La dernière étape consiste à récupérer les ARN dans de l'eau RNase free. Tu peux effectuer ton dosage par la suite sans soucis.  [...] Yep, je pense d'ailleurs que l'extraction se fait normalement en milieu alcoolique (qui va précipiter tes ARN) et que les reactifs du kit Qiagen ont pour objectif de nettoyer cet alcool à travers plusieurs étapes.  [...]

[Biochimie] Test eliza

apres lavage on procedera à la deuxieme etape avec la reaction specifique anti SAB, là on incubera pour 30 min.  [...] je pense que pour la première étape où on a mélange le SAB et le PBS et incuber pour 50 min était pour bien fixé l'antigene qui est le SAB au fond du puit... le PBS va etre un bloquant dans (il va aider le SAB à se fixer sur le fond de la plaque de microtitration )... vous en dites quoi.  [...]

variabilité microarray

D'une façon générale, les protocoles comportent un nombre d'étape assez important, donc les facteurs sont multiples (synthèse des sondes, type de lamelle, préhybridation, hybridation, lavage, séchage etc...).  [...] (j'avais oublié la qualité du spotting si la puce n'est pas commerciale et l'âge de la lame. Encore des étapes très importantes).  [...]