• Santé - étape, ARN, Free

RT PCR quantitative

Dans les 2 cas, je te conseille de préparer soigneusement des ARN ADN-free = après extraction de tes ARN, tu les traites à la DNase. J'utilisais le kit RNeasy de Qiagen (colones) en faisant le traitement à la DNAse (Qiagen) directement sur la colonne pendant l'étape de lavage des ARN.  [...] Comme ça la DNase est eliminée au lavage. Après l'élution tu as des ARN tous propres, sans DNase (problématique pour l'étape de PCR suivante.) et sans ADN génomique qui te donnerait des résultats faussement positifs et sur-estimés.  [...]

Extraction ARN totaux

Personellement, j'utilise les kit QIAGEN pour effectuer mes extractions. Cette méthode consiste à capturer les ARN totaux sur une colonne et de la nettoyer par la suite. La dernière étape consiste à récupérer les ARN dans de l'eau RNase free. Tu peux effectuer ton dosage par la suite sans soucis.  [...] Yep, je pense d'ailleurs que l'extraction se fait normalement en milieu alcoolique (qui va précipiter tes ARN) et que les reactifs du kit Qiagen ont pour objectif de nettoyer cet alcool à travers plusieurs étapes.  [...]

[biologie moléculaire] qualité d'ARN

Franchement moi je ne m'embête jamais avec les conditions RNase free pour faire migrer de l'ARN. De toute façon on ne se resert plus de ce qu'il y a dans le gel et il ne migre pas assez longtemps pour que la dégradation due au gel soit visible. Je module un peu en disant que je préfère faire migrer mes ARNs moins vite que les ADNs (100v alors que je peux monter jusqu'a 200v pour mes ADNs). Ceci parce que je trouve que c'est plus beau.  [...] En ce qui concerne les conditions RNase free. j'ai autoclavé mes solutions et rincé la cuve avec soude et sds puis eau stérile car je n'ai pas de DEPC. Si mes ARN sont dégradés j'adapterai de nouvelles conditions de manip.  [...]

[Biologie Moléculaire] la transcription in vitro

Es tu sure que la DNAse est RNAse free, as tu vérifiée ta transcription AVANT purification quelle taille fait ton ARN final mes transcriptions durent en moyenne au moins 2H, pour des ARN de 300 à 500nt.  [...] le Dnase est Rnase free, car il est neuf ainsi que j'ai migrai ARN sur gel et je voix ma bande qui est de taille 300nt. Ma transcription in vitro dure 2h.  [...]

[Génétique] Transcription inverse

Génial, merci beaucoup pour toutes vos réponses, je commence à comprendre quelques truc mais j'ai encore un petit problème. Dans mon mélange je met à la fois du DTT qui stabilise les RNases (vous m'avez dit) et des RNases OUT qui qui détruisent ces ARN, je ne comprend donc pas l'utilité de les stabliser si on n'en veut pas.  [...] De plus les ARN sur lesquels on travaille ont déjà été traité avec une DNase dite RNase free (une DNase sans RNase) alors pourquoi on doit encore rajouter une RNase OUT parce qu'on aurait pu contaminer la solution pendant la manip avec des RNases qui trainent un peu partout.  [...]

[Biologie Moléculaire] solubilité ADN, ARN dans le phénol

En revanche, pour l'extraction d'ADN avec du phénol basique, c'est pas vraiment clair. Des sites comme http.//www.chups.jussieu.fr/polys/bi...Y.Chp.7.3.html disent que l'ARN et l'ADN sont en phase aqueuse (mais dans ce cas, qu'est ce qui élimine l'arn) mais sinon, implicitement, on pense que l'ARN est dans la phase organique (d'où la purification différentiel des acides nucléiques en fonction du pH).  [...] merci de ces réponses. Une question en entrainant une autre. la méthode classique de purification d'adn est. lyse cellulaire (sds, PK) suivi de phénol/chlo et précipitation alcoolique (isoprop ou ethanol). Nulle part est fait mention d'une étape RNAse, DNAse free. Est ce que.  [...]

[Biologie Moléculaire] Solution Q du kit Qiagen

- Ensuite tu transfères ce surnageant sur la colonne de filtration. à l'aide de centrifugation et de différents lavages avec différents tampons (RPE, RW1) tu filtres ton surnageant. Les ARN restent accrocher sur la colonne.  [...] Il y a effectivement aussi une étape a la DNase. Mais celle-ci n'est cependant pas obligatoire. tout dépend de la manip que tu veux réaliser après avoir extrait tes ARN. Si avoir un peu d'ADN ne dérange pas, alors tu peux passer sur cette étape.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ARN

-Précautions de base quand tu veux bosser avec de l'ARN, enfin je penses que tu sais déjà ca. instruments et réactifs RNAse free, garder au max les cellules au froid tant que t'es pas dans un milieu (eg trizol) adequat pour éviter la dégradation de l'ARN.  [...] Oui tu peux ajouter du glycogène (je ne sais plus à quelle étape de l'extraction mais fouille un peu tu devrais trouver). Enfin le fait que tu dises ca me laisse penser que t'essaie de faire une extraction trizol à l'ancienne, avec peu de matériel de départ c'est pas franchement l'idée du siècle.  [...]

[Biotechnologie] primer extension

Pour avoir vu et fais pas mal de primer extension, les resultats ne sont malheureusement que rarement super clairs, entre les initiations multiples, les structures secondaires qui bloquent la RT...c'est parfois difficile de déméler le faux du vrai. Par contre si ta PCR amplifie un signal alors tu es certain que ton ARN est polycistronique.  [...] Avec la PCR, tu dois d'abord verifier avant ta RT que ton ARN est DNA free donc une PCR, puis souvent un deuxieme traitement a la DNase, puis la PCR pour determiner si l'ARN est polycistronique ou non... ca fait une journee de manip, 2 PCR, 2 gels avec du BET etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] le gel idéal??

Je ne sais pas ce que tu veux faire avec ton ADN, mais si tu le quantifies A 260 il faut d'abord que tu degrades l'ARN et que tu repurifies l'ADN, sinon ta concentration va etre plus que fausse. Generalement dans les extractions old school il y a une etape de traitement a la RNase avant la precipitation.  [...] Ce que vous vouliez était évaluer la qualité de votre extraction. Si vous souhaitez éliminer toute trace d'ARN ajoutez de la RNase et allongez un peu l'étape.  [...]