• Santé - Construction, Plasmide, Bactéries

[Biologie Moléculaire] Protocole de recombinaison homologue chez les bactéries

J'ai un gène sur un plasmide que que je voudrais insérer dans le génome principal d'une bactérie. Après avoir fait la construction sur le plasmide et transformé les bactéries, connaissez vous le protocole à suivre pour insérer le gène par recombinaison homologue.  [...] Je relance cette question. quelqu'un connait il un protocole clair pour faire de la recombinaison homologue chez les bactéries afin de faire passer un gène modifié qui est sur un plasmide au chromosome principal.  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Oui, juste compléter. par la néomycine + strepto, tu sélectionneras les bactéries ayant un plasmide recombiné (on nous demande toujours de faire cette vérification pour être sûr que le plasmide porte bien le gène d'intérêt). Plus intéresant serait de faire une construction avec LacZ à la place du gène de la béta-Lactamase.  [...] Oui, juste compléter. par la néomycine + strepto, tu sélectionneras les bactéries ayant un plasmide recombiné (on nous demande toujours de faire cette vérification pour être sûr que le plasmide porte bien le gène d'intérêt).  [...]

Faire suivre une promoteur eucaryote et procaryote

En étudiant la structure d'un plasmide servant a faire de la transgénèse via agrobacterium, j'ai rencontré un soucis avec la structure du gène de résistance. Le gène utilisé est le gène de résistance a la kanamycine, NPTII (pour néomycine phosphotransférase II).  [...] Dans la construction du plasmide il est précédé du promoteur du CaMV 35S. Cependant pour réaliser la selection des bactéries transformé puis des cellules végétales transformé, on a besoin de l'expression de NPTII à la fois dans les bactéries et les cellules eucaryotes.  [...]

Intégration dans un plasmide

Savez vous comment s'effectue l'intégration d'un gène dans un plasmide bactérien (Le gène a déjà réussi a pénétré dans la bactérie grâce à la transformation).  [...] Donc on fabrique un plasmide recombinant in vitro (en y introduisant le gène voulu) et on transforme les bactéries avec cette construction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagenèse: Pb...

En fait en faisant d'autres mutations sur la même matrice d'ADN, on observe des clones bactériens. De même une PCR screen de ces mêmes clones montrent la présence du plasmide.  [...] Chez d'autres bactéries comme E. coli DH5 alpha, avec 10 ng de plasmide on a un nombre de colonie énorme sur boite. Donc faire preuve de retenue lorsque l'on n'est pas d'accord avec un protocole fonctionnant pour quelqu'un d'autre me parait judicieux.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Voilà, je continue gaiement mon stage à Barcelone, mais maintenant j'ai un petit souci. je dois faire une construction plasmidique toute simple, donc digestion de l'insert et du vecteur par 2 enzymes de restriction, ligature, et puis transformation de bactéries E. coli.  [...] Non, je ne vais pas transformer Agro avec une construction pBSK, mais avec une autre construction sur le plasmide T qui contiendra le fragment que j'aurai amplifié sur E. coli. Ce plasmide servira ensuite à transformer mes plants.  [...]

Transformation/inativation d'un gène

Ok, don si j'ai bien compris je construis mon plasmide avec les extrémités du mon gène a déléter, plus un gène de sélection, et après il faut transfecter ce plasmide donc le champignon.  [...] Dans ce cas tu dois transfecter de l'ADN linéaire, tu fais ta construction et tu linéarises. Si tu as créé une cassette dans ton vecteur bactérien tu purifie après linéarisation. Si tu veux utilisé tout le plasmide en entier je passerai sur gel quand même pour être certain que tu as que de l'ADN linéaire.  [...]

Les colonies satellites dans un milieu aditionné d'Ampicilline

Oui c'est correcte maintenant. j'ai compris que le but d'ensemencer ces cellules transformées dans le milieu LB+Amp est justement pour les sélectionner, parce que j'arrivais pas à trouver le rapport (milieu ampicilline/bactéries sensibles)... mais je vois que c'est un cas particulier pour l'ampicilline, puisqu'il a un pouvoir bactériostatique, les bactéries sensibles peuvent également pousser donc ici c'est les cellules satellites qui sont sensibles à l'ampiciline et qui portent la construction plasmidique.  [...] Tu fais ta transfo sur l'antibio 2 ou 3 (tu as dis que tu avais 2 autres résistances sur ton plasmide qui ne doivent pas être altérées par ton insert). Ca veut dire que seul les bactéries portant le plasmide (transformées) seront sélectionnées.  [...]

Sens de lecture d'un plasmide

Je tente de faire une construction à l'aide d'un programme et j'ai trouvé la séquence de mon plasmide. J'ai repéré les sites de restriction à utiliser qui seront de part et d'autre de mon gène.  [...] Seulement je me pose la question de l'orientation de mon gène. Tout d'abord comment savoir où se trouve le 5' et où se trouve le 3' du plasmide J'ai une séquence qui est numérotée de 1 à 5369. Le 5' commence toujours en 1.  [...]

Technique Gateway

alors qu'en général la construction de chaque plasmide séparément prend entre 2 jours et... une éternité. (= il y a des plasmides qu'on n'arrive jamais à obtenir).  [...] On passe d'abord par une première recombinaison en plasmide donneur et on obtient un clone d'entrée. Tu va pouvoir multiplier ce plasmide et en stocker une grosse partie, afin de réaliser d'autres clonages ultérieurs, dans des tas de vecteurs de destination différents. D'où l'intérêt de cette étape supplémentaire.  [...]