• Santé - Colonies, Boîte, AMP

[Biologie Moléculaire] Problème de tranformation

Et la encore, après toute les vérification, j'ai des colonies sur ma boite (bcp de blanche et quelques bleus), mais aucune ne pousse lorsque je passe en milieu liquide (LBamp). Le plus intrigant, c'est que j'ai tenté de repiqué une bleu dans mon LB amp liquide, et là ça pousse nickel.  [...] Mais j'ai peut être trouvé une explication, il semblerait en effet (en vu de ce que j'ai pu lire à droite à gauche) que mon AMP ne soit pas assez concentré sur mes boites ce qui ne suffit pas à faire la pression de sélection correctement et mes colonies perdent le plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] cellules compétentes DH5a

en vu de clonner un fragment de gene, jai commencé par préparer des cellules compétentes DH5a, par traitement avec la glace. 20min dans la glace suivies par des lavages avec le glycerol. Aprés la transformation par électroporation, j'ai trouvé des colonies sur la boite LB+Amp de controle négatif( cellules DH5a sans vecteur) sur les autres boites LB+ Amp+ IPTG+ X-Gal j'ai trouver des colonies blanches et des colonies bleu.  [...] Le fait d'avoir des colonies sur ta boite controle indique que soit tu t'es trompé et tu as mis du plasmide la ou il ne fallait pas. soit que tu as une legere contamination (ca depend aussi du nombre de colonies que tu as).  [...]

Plasmide et gène LacZ

Au final, dans un milieu contenant de l'ampicilline et le substrat pour le gène LacZ (X-gal et IPTG), on sélectionnera les colonies bactériennes blanches qui seront recombinant (les bleues ne seront que transformant).  [...] Je pense qu'il y a une erreur parce que les bactéries non transformantes ont déjà été éliminées par l'action de l'antibiotique (Amp). Le système LacZ permet de différencier les bactéries (ou colonies) qui ont un plasmide avec l'insert (bactéries transformantes recombinantes) et celle qui ont le plasmide sans l'insert (bactéries transformantes non recombinantes) de part la couleur des colonies observées sur boîte de Pétri (si le milieu est préparé avec de l'IPTG et du XGal).  [...]

Plasmide recombinant

L'ampicilline est l'antibio classique qui permet de sélectioner les bactéries qui contiennent le plasmide quand tu les transformes (seuls poussent les bactos qui ont le plasmide). C'est l'étape de la contruction et de la sélection.   [...] cette sélection s'effectue en étalant les bactéries transféctées sur une boite d'agar contenant la Tet, toutes les colonies obtenues de cette façon contiennent un plasmide.ces colonies résistantes sont ensuites téstées pr leur capacité de croitre sur un milieu contenent l'Amp.  [...]

Les colonies satellites dans un milieu aditionné d'Ampicilline

c'est claire que ces colonies satellites sont résistantes à l'Ampicilline donc non transformées. les bactéries transformées ne doivent pas pousser sur ce milieu qui est normalement un milieu sélectif. il faut choisir une autre méthode d'ensemencement, pour sélectionner les bactéries transformées.  [...] Sur ta boite Antibio 2 (sur lequel tu as fait ta transfo), imagine que tu as 20 transformants. Ce que tu fais, c'est que tu les numérotes (par exemple tu en prend 10). Chaque colonie (= numéro) représente donc un background génétique. Ensuite tu prend un tip, tu prend la colonie 1 avec et tu fais d'abord une strie sur LB Amp puis sur une boite LB antibio2 (tu gardes le même tips, c'est a dire le même ensemenceur, c'est à dire les mêmes bactéries).  [...]

La transgenèse bactérienne

Cette étape 5 permet, comme c'est indiqué, de laisser le temps à tes bactéries de produire la protéine de résistance à l'ampicilline. Si tu étales tes bactéries sur boîte juste après l'étape 4, elles n'auront aucun moyen pour se défendre contre l'antibiotique les pauvres.  [...] Tu vires alors 0,7 mL de ton surnageant et il te reste environ 0,1 mL dans lequel tu resuspends tes bactéries. Tu travailles donc toujours dans tes deux tubes (+ et -) de départ. Tu étales alors les 0,1 mL sur de nouvelles boîtes avec ampicilline, ce qui te permettra de voir qu'en déposant 10 fois plus de bactéries du tube + (8 fois plus pour être précis plutôt), tu as sur ta boîte environ 10 fois plus de bactéries résistantes. Et toujours rien pour le tube -.  [...]

[Biologie Moléculaire] Passer d'une miniprep à une maxiprep

J'ai purifié un produit de pcr que j'ai essayer d'intégrer par éléctroporation dans des bactéries... J'ai laisser les bactéries pousser toute une nuit sur boite de pétri et j'ai ensuite piqué 22 colonies positive (sélection blanc-bleu) pour vérifié qu'elle contenait l'insert ou non.  [...] Je pense donc pour cela étaler de la miniprep sur boite et ensuite repiqué une de ces colonies dans 3ml LB puis faire ma midiprep.  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Donc vérifier que tes bactéries sans plasmide sont bien sensibles aux deux antibios, et d'abord faire pousser les bactéries transformées sur strept, puis repiquer les colonies en les identifiant sur ampicilline, puis tester par miniprep celles qui ne poussent pas sur ampicilline.  [...] Le plasmide de départ est StreptoR et AmpR. Donc, si j'ai des colonies sur LB+strepto+amp, c'est que les bactéries ont intégré le plasmide natif.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage TOPO dans JM-109

Avant ma thése j'utilisais le même vecteur, avec des bactéries differentes (XL1-lue), le même protocole et ça fonctionnait du tonnerre.   [...] Disons que je pencherais plutot pour une incompatibilité entre le vecteur topo et les bacteries JM-109...pour une raison qui m'est encore inconnue.   [...]

[Evolution] Origines de l'ARN

J`ai bien aimé cet article. Ce que j`ai trouvé intéressant, mais pas seulement, est qu`ils ont irradiés à l`u.v. et réussis à détruire plusieurs co-produits interférant dans la formation d`ARN suite à la formation du ribonucléotide cytosine activé (dans un tampon phosphate entrant dans plusieurs étapes du mécanisme).   [...] Tout à fait. Mais il a bien fallu que le vivant à l'origine exploite une source d'énergie libre, et l'exploite de manière à ce que les réactions métaboliques aillent dans le sens de la construction, de la structuration.   [...]