• Santé - Colonies, ADN, Contrôle, Transformation, Vecteur

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Donc effectivement, on peut avoir culture sur le contrôle puisque le vecteur est résistant à l'ampicilline (j'ai tendance à pas mal m'embrouiller avec tout ça). D'après ce que tu dis pour le contrôle négatif, un vecteur qui n'a pas inséré d'insert ne va pas entrer dans les bactéries lors de la transformation bactérienne et du choc thermique Le vecteur ne peut pas entrer seul dans les bactéries.  [...] La seule chose que je peux te dire c'est que la manip de transformation des bactéries par le vecteur seul a raté, et qu'un très faible nombre de colonies a donc pu se développer. Par curiosité, combien de colonies par µg d'ADN as tu obtenu dans le contrôle et dans la transformation avec vecteur + insert.  [...]

[Biologie Moléculaire] cellules compétentes DH5a

en vu de clonner un fragment de gene, jai commencé par préparer des cellules compétentes DH5a, par traitement avec la glace. 20min dans la glace suivies par des lavages avec le glycerol. Aprés la transformation par électroporation, j'ai trouvé des colonies sur la boite LB+Amp de controle négatif( cellules DH5a sans vecteur) sur les autres boites LB+ Amp+ IPTG+ X-Gal j'ai trouver des colonies blanches et des colonies bleu.  [...] le vecteur possede un gene de resistance a l'ampicilline et apporte donc la resistance à l'ampicilline quand il transforme une bactérie DH5a. Or si la bacterie est deja resistante a l'ampicilline avant la transformation, tu ne peux pas distinguer les bactéries transformées des bacteries non transformées resistantes à l'ampicilline.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

Tout ça fait que dans la culture contrôle (sans insert), tu devrais avoir moins de colonies que dans la culture ou tu as inséré le vecteur et l'insert puisque le vecteur est en principe incapable de se linéariser.  [...] Le rapport nombre de colonies dans la boite témoin/nb de colonies sur la boite insert_vecteur donne une bonne indication de la réussite de la ligation et de l'incorporation de ta construction dans le vecteur. Il y a en général quand même des colonies dans la boite controle, prinicpalement parce que il subsiste quelques exemplaires circulaires de ton vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.

Déjà une chose, ça a pris plus de temps que d'habitude pour avoir des colonies. Le contrôle positif fait avec un de mes vecteurs et les cellules a donné des colonies après une nuit (normal). Pour mes plaques de transformation, j'ai du attendre 1 jour pour avoir des coloniees bien visibles.  [...] Ce qui me semble étrange, c'est que si l'ampicilline était vraiment inactif, j'aurai du obtenir beaucoup plus de colonies sur mes plaques de contrôles et de transformation (en moyenne 40 colonies obtenues). Mais j'ai vraiment du mal à comprendre comment c'est possible d'avoir les colonies blanches et de n'avoir aucun ADN plasmidique sur le gel ensuite.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation??

J'ai d'une part fait une ligation avec mon plasmide(digéré), l'enzyme et sans mon insert et d'autre part le plamide,l'insert et l'enzyme je n'ai donc pas de contrôle plasmide liguer par contre je ne pense pas que se soit forcement la transformation vu que d'habitude je n'ai pas de problemes mais j'ai tout de même un petit doute sur la ligation avec la TAKARA qui préconise 5min à 25°C ou 30min à 16°C j'ai donc essayé les deux methodes et j'ai même prolongé à 2h30 à 16°C donc est ce que quelqu'un a déjà eu un soucis avec cette enzymz car les temps de ligation me semblent courts...sinon je ne vois pas.  [...] Ce que tu peux ensuite contrôler si tout ceci a fonctionné, c'est si EcoR1 clive bien le vecteur après l'action de BamH1 (ou l'inverse). clivage vecteur avec BamH1 puis ecoR1 (ou l'inverse) et ligation puis transformation. Normalement tu n'auras aucune colonie, mais je te conseille de faire un témoin clivage BamH1 + ligation + transformation, car le second clivage n'est pas forcément fiable à 100%, donc la présence de quelques colonies ne veut pas dire qu'EcoR1 derrière BamH1 est totalement inefficace.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

J'ai testé les différentes propositions que vous m'avez faites. J'ai pu obtenir des colonies ce matin. Seulement, il y a un souci, j'ai des colonies dans ma transformation témoin (bactéries transformées avec le vecteur ligaturé sur lui même). Je vais prendre le pari ce matin et essayer de faire des PCR de colonies pour voir si les fragments d'intérêt on bien été cloné.  [...] Je suis également nouvelle sur le forum. Cette discussion a attirée mon attention car moi aussi j'essaye de sous-cloner un insert de 4kb dans un vecteur pET28a (5.4kb) depuis 2 semaines je n'y arrive pas. J'ai toujours quelques colonies après transformation mais lorsque je vérifie si la ligation a fonctionner je ne retrouve pas mon insert.S.  [...]

[Biologie Moléculaire] pb de mutagenèse dirigée

mon problème est que je n'obtient pas de colonies avec mon plasmide recombiné, les témoins de mutagenèse et de transformation sont OK, j'ai bien des colonies bleues et blanches. mais les bactéries traitées avec mon plasmide ne poussent pas sur le milieu de culture LB+ampicilline quelque soit la quantité d'ADN ou de solution bactérienne étallée.  [...] soit le problème est au niveau de la PCR, soit au niveau de la transformation. mais alors pourquoi les témoins marchent et pas mon plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

Malheureusement, le lendemain aucune colonie sur les boîtes. J'ai refais toutes les manipulations plusieurs fois et je ne sais pas si s'est un problème lors de la ligation ou de la transformation.  [...] 1 contrôle de transformation, avec une dizaine de picogrammes de pUC18 ou équivalent pour des bactos électrocompétentes qui sont attendues à une efficacité de 10^8 colonies par ug de plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage petit fragment d'ADN

Fais tu une transformation contrôle avec l'insert seul déphosphoré + ligase Y a-t-il autant de colonies que dans plasmide + insert.  [...] oui, c'est donc le vecteur seul déphosphorylé qui sert de contrôle de transformation et non l'insert seul déphosphorylé comme tu le disais.  [...]

Les causes du cancer ? - Page 10

Je dirais plutôt que le cancer est la manifestation de l'évolution d'un clone issu d'une cellule souche ayant acquise des propriétés qui lui confèrent le statut de malignité suite à l'accumulation de mutations somatiques se traduisant notamment par une altération des mécanismes de réparation de l'ADN et de l'apoptose, une absence de contrôle des mitoses avec perte de l'inhibition de contact et l'apparition d'une immortalité, une différenciation plus ou moins prononcée et le pouvoir d'établir des colonies à distance (métastases).  [...] Il est exact que les mécanismes de contrôle et de réparation ne sont pas efficace à 100 % ce qui explique qu'avec l'âge on accumule des cellules de plus en plus dégénérées. Ces mécanismes n'étaient pas connus à l'époque de Gernez, celui-ci a tenté d'apporter une réponse en proposant sa théorie de suppléance fonctionnelle des cellules anormales pour faire face au tarissement des cellules souches.  [...]