• Santé - Clonage, Transformation, Bactéries, Compétentes

[Microbiologie] mutagenèse dirigée par pcr

j'ai effectué une mutagenèse dirigée par pcr pour modifier trois codons de la séquence de la souche Mycoplasma meleagridis je trouve toujours des difficultés lorsque je mute plus qu'un codon en plus au moment de l'assemblage je trouve toujours des bandes non spécifiques pourtant j'ai modifier les paramètres physiques (température) ainsi que les paramètres chimiques.   [...] mon encadreur m'a demandé de ne pas passer par l'étape de clonage préalable, de muter le gène en question par la méthode des 4 oligos et de passer directement à l'étape suivante qui clonage transformation des bactéries compétentes pour exprimer le gène muté, moi aussi je me pose des questions parce que dans tous les articles que j'ai lu j'ai trouvé que les chercheurs ont procédé d'abord à un clonage après ils ont effectué trois pcr successives après ils ont passé à l'étape de transformation des bactéries moi je dois zapper la première étape je n'ai pas osé lui poser la question pour qu'elle raison à votre avis.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.

A mon avis ce qui c'est passé c'est surtout que votre transformation a foiré et que des bactéries ampi résistantes vides ont poussé quand l'ampi a commencé a devenir limitant.  [...] Je n'ai jamais utilisé de bactéries éléctro compétentes donc je ne peux pas vous aider à optimiser vos transformation. J'ai une grosse préférence pour les chimio compétentes.  [...]

[Génétique] Help! tp génétique, analyse clonage

Comment les bactéries sont-elle rendues compétentes Par quelle technique Et qu'est-ce que la transformation précisément.  [...] Ou plutôt les bactéries étaient compétentes (électro- ou thermocompétentes) et vous avez fait une transformation avec vos plasmides recombinants au sein desquels vous aviez auparavant cloné un insert.  [...]

[Biochimie] Mutagénèse dirigée

A ne pas négliger, le fait que tu es choisi d'autres bactéries que celle du kit. Sont-elles compétentes pour une transformation par choc thermique Est-ce les mêmes que celles utilisées pour les clonages qui ont fonctionné précédemment.  [...] Le problème est probablement résolu depuis belle lurette, mais si quelqu'un est dans le même cas de figure, j'apporte tout de même mon grain de sel. Je pense que le problème est bel et bien que la transformation n'est pas fait dans la bonne bactérie. En effet, les plasmides issus de cette mutagénèse ne sont pas fermés, ils doivent donc être transformés dans des XL1 qui a la capacité de lier les deux bouts du plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] vecteur

Les bactéries contenant les plasmides sont mises en culture dans un grand volume (jusqu'à 2 litres de milieu de culture). Quand la concentration bactérienne atteint une valeur suffisante, on traite par un antibiotique (comme le chloramphénicol) qui empêche la croissance bactérienne sans affecter la réplication des plasmides.  [...] Les bactéries peuvent être placées dans certaines conditions physico-chimiques pour permettre aux plasmides d'être incorporés à l'intérieur de celles-ci. Les bactéries traitées et prêtes à recevoir l'ADN étranger sont appelées bactéries compétentes. L'incorporation des plasmides dans les bactéries est appelée transformation bactérienne.  [...]

clonage

donc je suis vraiment dzl de vs déranger mais je veux juste savoir prk passé par le clonage dans des bactéries alors que le le produit de PCR va être déjà amplifié avec des amorces spécifiques du gène d'intérêt ciblé par les TALEN, un gel d'agarose suffit d'après mon raisonnement.  [...] J'imagine que la mutagénèse par cette technique des TALENs (c'est un produit commercial, regarde sa notice) se fait in vivo donc en utilisant la machinerie de la bactérie (ou d'un autre organisme), le clonage du produit de PCR dans le vecteur permet de travailler avec le produit in vivo.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Voilà, je continue gaiement mon stage à Barcelone, mais maintenant j'ai un petit souci. je dois faire une construction plasmidique toute simple, donc digestion de l'insert et du vecteur par 2 enzymes de restriction, ligature, et puis transformation de bactéries E. coli.  [...] Ensuite ce matin j'ai transformé mes bactéries compétentes, là elles sont mises à pousser sur des boîtes avec ATB, IPTG et X-Gal. On va voir ce que ça donne.  [...]

Intégration dans un plasmide

L'ADN circulaire pénètre plus facilement dans des bactéries (préparées pour la transformation. on dit qu'elles sont compétentes ) que l'ADN linéaire.  [...] Je ne pense pas qu'il soit possible d'insérer dans une bactérie hôte un ARN linéaire, sauf si on utilise un phage comme vecteur. Dans ce cas si, tes rendements sont drastiquement augmentés car la transformation de bactérie compétente est relativement peu rentable.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage TOPO dans JM-109

J'ai effectué la ligation dans le vecteur topo pCR®2.1 et la transformation dans des bacteries compétentes JM-109 (via choc thermique).  [...] le protocole c'est du grand classique ligation (vecteur+insert (purification)+solution de sel). 15 min à température ambiante. Puis transformation avec choc thermique (45 sec à 42°C).  [...]

isolation d'un plasmide

S'assurer que la bactérie ne possède pas de plasmide avant la transformation Et bien en principe, elles ne possèdent pas le plasmide d'intéret (logique). Tout autre plasmide nous est indifférent. Ce que l'on fait en pratique, c'est que l'on verifie après coup que les bactéries que l'on a selectionnées portent bien l'insert d'intéret (digestion de restriction, séquencage).  [...] Les bactéries compétentes utilisées pour la transformation et l'amplification ne possédent pas de plasmides... pour t'en rendre compte, fait, à partir d'une colonie, une culture de bactéries non transformées d'une part et transformées d'autre part... fait ensuite une miniprep d'ADN plasmidique.  [...]