• Santé - Cellules, Tampon, Protocole

[Biologie Moléculaire] Tampon de lyse extraction ADNg

Je dois réaliser une extraction d'ADNg à partir de cellules de lignée lymphocytaire. Je possède déjà les culots cellulaires congelés, et j'ai déjà un protocole d'extraction phénol/choloroforme. Mon seul souci, c'est que je n'ai pas de tampon de lyse maison pour mes cellules, ni de protocole de lyse.  [...] J'ai cherché sur ce forum, et Yoyo disait qu'il avait un protocole d'extraction ( http.//forums.futura-sciences.com/se...archid=4618296 ). Si tu lis ce message Yoyo, et que ton protocole parle d'un tampon de lyse, pourrais-tu me l'envoyer par MP Je t'en serai très reconnaissant.  [...]

surproduction et purification de proteine

je suis entrain de surproduire la topoisomerase topI de campylobacter jejuni grace a une induction a l 'itpg la je vais entamer ma purification j ai quelaue idees pour mon protocole mais est ce que y a des personnes qui ont deja fait de la purif de proteine j aimerai avoir un apercu pour precider ma purification c est par un his tag.  [...] _ Les grandes lignes de mon protocole de purif de ma prot (sachant que je congelais mes culots de bactéries transformées de 500 mL de culture, visuellement c'était un peu moins que le volume de l'extrémité conique d'un Falcon 50). un culot + 25 mL de tampon, reprendre doucement, sonication 7 min à 150 V dans la glace pour casser les cellules, centri 30 min 35000 rpm 4°C, surnageant chargé sur colonne Ni-NTA de 2 mL équilibrée avec le tampon.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ARN

c'est laaaargement suffisant pour descendre les cellules, s'il y en a. Vous devriez faire un comptage pour voir combien vous avez de cellules (ou une mesure de la quantité d'ADN avec une technique très sensible). A mon avis le problème ne vient pas du protocole mais de la pauvreté en matériel.  [...] Vous rajoutez une étape (non nécessaire selon moi) qui constitue une occasion supplémentaire de perdre du matériel. Vous devriez essayer de lyser le culot de cellules dans le tampon fourni et de suivre le protocole, si ça se trouve le problème sera résolu.  [...]

[Biologie Cellulaire] Mesure de l'activité d'exocytose de la HRP chez l'amibe (Niveau L2)

Lors d'un TP de biologie cellulaire nous avons mesuré l'activité d'ENDOCYTOSE de la HRP par l'amibe en faisant un suivi spectrométrique de la HRP des cellules d'amibe préalablement lavés, centrifugés, lysés en y ajoutant le substrat de la HRP. le TMB.  [...] Ton protocole est tout à fait juste. Peut-être une petite étape de lavage à 4°C avant de les suspendres dans ton tampon d'exocytose afin d'éliminer des HRP qui serait associées de manière non spécifique aux cellules. (Et à 4°C pour bloquer l'exocytose afin de ne pas démarrer l'exocytose avant le lavage).  [...]

Résultats | Dossier

D'un point de vue pratique, la méthode est la suivante. dans 1 ml de sang est ajouté si nécessaire, le stimulant et le tout est mis à incuber pour une durée définie. Ensuite, les suspensions sont hémolysées par ajout de 5,6ml de NH 4 Cl, puis les milieux sont centrifugés à 400g pendant 10 minutes, les culots sont repris par 500 µl de tampon de lyse, la suite du protocole est identique à celui utilisé dans le cas des cellules précédentes.  [...] Toutes les autres molécules, à savoir le CHP 42, le CHP164, le PCH 46, le PCH 50, le PCH 52, le PCH 57, le PCH 67 et le PCH 76 ont pu être testés selon le protocole mis au point.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins

Pour les extraits, j'utilise ce protocole sur du foie et sur des cellules, ça revient au même. Il faut faire attention a ne pas mettre trop de tissu dans le tampon, l'idéal étant de peser environ 30mg pour voir ce que ça fait. Grosso modo, une tete d'allumette dans 500µL et tu as de quoi faire des centaines de western.  [...] oui, je me ferai aider. Mais avant j ai quand meme besoin d un protocole.Le probleme c'est que je pars de rien. Dans le labo, ils ont dosè d autres proteines, pas celles la. De plus, ils le font souvent sur des cellules en culture. Cest pour cela que je suis un peu perdue. J'attens ton message demain.  [...]

[Biochimie] extraction protéines membranaires à partir de tissu cérébral congelé (pour étude de co-IPP)

Le NP40 est trop un détergent trop doux pour moi si tu veux détruire tes membranes. Je travaille sur des cellules en culture donc mon protocole sera légèrement différent, mais si j'étais toi j'essaierais tampon un tampon de lyse 1% NP40 et 1% SDS (il y d'autre composant mais je n'ai pas la liste sous les yeux, je pourrais te dire ça plus tard si tu y tiens).  [...] Merci de ta réponse. ok je veux bien le protocole quand tu l'auras =) EN reveanche je travaille sur des petites zones de cerveau congelé (1 à 2 mg en tube Eppendorf 1,7 mL), donc je ne pense pas avoir besoin de soniquer, qu'en penses -tu sinon, as-tu un protocole de coIPP j'en ai déjà mais j'aimerais en tester plusieurs, donc je mets toutes les chances de mon côté.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème : oublié centri sur cellules dans tampon de lyse => WB????

j'ai essayé de résumer mon pb dans le titre. En fait j'ai mis mes cellules adhérentes dans du tampon de lyse pour immunoprécipitation, mais j'ai oublié la centrifugation et je n'ai donc pas récupérer les membranes et noyaux. Donc là j'ai ajouté mon sample buffer mais biensur j'ai ma fraction qui est trop visqueuse pour être déposée en blot. que dois je faire pour pouvoir déposer.  [...] D'autre part, la viscosité peut-être éliminée en chauffant. ce qui rend l'extrait visqueux c'est le DNA essentiellement. Après le problème peut aussi venir de la quantité de cellules que tu as lysé.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR qui veut pas marcher

Pour le protocole, je pense que c'est un protocole classique. eau, tampon, MgCl2, dNTP, couples d'amorces et GoTaq. Le tout pour un volume de 25µl. Je fais en tout 35 cycles au thermocycleur et l'identification se fait sur un gel d'agarose à 1% avec du GelRed.  [...] Après plusieurs PCR, je n'avais plus de produit pour mon mix et j'ai du donc en changer. J'ai changé le MgCl2, le dNTP et le tampon. J'ai du aussi utiliser un autre thermocycleur en gardant le même protocole. Apparemment les température d'hybridation n'était pas en cause.  [...]

Comment gérer cette situation en stage?

Bon après je commence le stage, c'était le 5 janvier. Le premier jour était assez intéressant, j'ai redécouvert comment faire un elisa, avec un kit contenant les anticorps que je devais diluer, les mettre à adsorber sur les puits, j'ai aussi fait de la culture cellulaire (un passage de cellules classiques) et ma responsable m'a aussi montré comment filtrer du BSA pour faire un tampon pour de la chromatographie.  [...] Malheureusement, j'ai utilisé le mauvais tampon pour les cellules (apparemment pas adapté pour les LT) alors que dans la précipitation, en m'expliquant tout le truc super vite, elle m'avait bien dit d'utiliser ce tampon.  [...]