• Santé - Cassette, Restriction, Site

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

L'amplification par PCR va donner des amplicons non méthylés (et aussi ne contenant plus ta cassette vu que l'amplification du vecteur exclura la cassette). Tu ajoutes à ton produit de PCR l'enzyme DpnI qui va cliver l'ADN méthylé en fragments de quelques centaines de bases (enzyme de restriction reconnaissant un site de 4 bases méthylé).  [...] Ainsi, seul ton vecteur d'origine (celui contenant ta cassette) sera digéré par cette enzyme, et pas ton produit de PCR, ce qui te permet de bien te débarrasser de ta cassette.Cela pourrait être une stratégie de rechange par rapport à ta stratégie actuelle qui est de simplement extraire la cassette avec des enzymes de restriction correspondant à ton futur site d'insertion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide

Je dispose de deux enzymes de restrictions, une XhoI qui possède deux site de restriction dans la cassette de polyclonage. l'autre enzyme est MluI cependant sur le schema du plasmide je n'ai pas son site de restriction donc je ne sais pas ou elle coupe.  [...] oui tu peux, sous certaines conditions. Il faut un site de restriction dans le vecteur, et un autre dans l'insert (pas au milieu de l'insert). Selon que l'insert est dans un sens ou dans l'autre, tu auras deux fragments différents en taille. Pour l'histoire du plasmide natif j'aurais dit que c'etait le vecteur seul.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteurs de clonage

Vous devez pouvoir produire la protéine, ce qui signifie que la séquence codante va être transcrite et traduite. Le traduction va s'opérer grâce à la machinerie bactérienne, pas de souci. En revanche, la transcription va nécessiter la présence d'un promoteur sur le vecteur, c'est la première chose que vous devez chercher.  [...] Ceux qui n'en ont pas sont à éliminer. Ensuite, il faudra que vous verifiez 1. qu'un des sites de restriction de la cassette de clonage peut être utilisé (le site de restriction ne se trouve pas dans votre séquence codante), et 2. que ce site permet un clonage en phase avec un éventuel start de transcription présent sur le vecteur (vérifier aussi si il y en a un ou pas d'ailleurs).  [...]

ADN de séquence inconnue, choix des enzymes de restriction.

Je pense à des procédés comme la I-PCR, ou à l'utilisation de marqueurs radioactifs pour détecter l'emplacement des fameux sites de restriction mais tout cela reste assez vague.s.  [...] Si j'ai un fragment inconnu j'aurais tendance à ne pas essayer de couper mais à utiliser la Klenow ou la TNK4 pour rendre les extrémités du fragment franches. Du coup, j'ouvre le vecteur avec une enzyme de restriction qui génère des extrémités franches, et dont le site de restriction se trouve dans la cassette de clonage, et je ligue.  [...]

[Biochimie] nouvelle sur le forum et besoin de vs pour du clonage, help

le système cellulaire est eucaryote. des cellules humaines issus de l'endothélium vasculaire.Il est vrai que je suis complétement néophyte à tout cela, et j'ai essayé de designer des primers avec des enzyles de restriction bien particulières, mais je ne sais pas si ce que j'ai fait est vrai, car je me suis positionné bien avant mon ATG pour designer mon primer sens, et je ne sais pas si cela décaleras mon cadre de lecture entre autre.  [...] On voit la tronche de la cassette de clonage en page 3. On voit qu'il y a déjà un start dans le plasmide et un codon stop sur le site de restriction XbaI. Vous devez donc retirer le start de votre gène et éventuellement le stop.  [...]

plasmide et BAMH1

je dispose d'un plasmide comportant une cassette de clonage avec les sites de restriction spécifiques à.  [...] Tu as un plasmide recombinant donc il possède le gène. Une fois qu'on l'a, on met l'enzyme Bam H I. Sur le plasmide recombinant il y a donc 3 sites de restriction Bam HI. celui du plasmide seul et les 2 du gène qui est dans le plasmide. Donc trois coupures.  [...]

transposon

Un transposon composite comporte d'autre gènes que celui de la tranposase. Sinon, on parle simplement de séquence d'insertion (IS), enfin il me semble que c'est ça.  [...] Seul les intégrons sont classifiés en fonction de leurs structures. Les intégrons sont composé d'une intégrase, d'un site d'intégration (att) et d'une cassette de genes. Il y a 3 classes d'intégrons. en fonction de leurs contenus en gène et de l'identité des séquences flankantes.  [...]

[Génétique] plasmide suicide et gène cassette :s

-la deuxième. utiliser un gène cassette (par exemple x1-p1) d'après la technique Datsenko et wanner (j'ai essayé de lire de la biblio dessus mais j'ai totalement été larguée).  [...] Mais pour que cette cassette aille remplacer le gène x initial, il fallait bien qu'il y ait un site attc à côté de ce gène non Comment ça se fait Dans une bactérie je ne pense pas qu'il y ait un gène attc à côté de chaque gène.  [...]

[Biochimie] clonage

Non pas nécessairement. Si les deux sites de restrictions sont dans la cassette de clonage (ce qui doit être le cas), alors on retire entre 10 et 50 pb que l'on ne verra pas sur gel. Le plasmide semblera simplement linéarisé.  [...] y a-t-il assez de bases de part et d'autres des sites de restriction sur les oligos Certaines enzymes ne peuvent digérer au bord du brin et ont besoin de quelques bases pour avoir une bonne assise.  [...]

[Biotechnologie] Fabrication d'une protéine d'intérêt ?

Un vecteur d'expression est un plasmide (un morceau d'ADN spécifique des bactéries) circulaire qui a été trafiqué dans sa séquence pour être utilisé pour exprimer des protéines. En gros, on utilise habituellement des enzymes de restriction pour couper l'ADN et introduire de l'ADN, ce plasmide en contient beaucoup, positionner après un site qui induira la trancription du fragment ajouté en ARN.  [...] Oui, quand tu inclues le prix que te coûte un technicien (dans les 150 euros/jour) cela peut vite devenir rentable. Et puis l'optimisation de codons, la possibilité de mettre des sites de restrictions pratiquement où on veut, c'est fort pratique. Par exemple, il suffit de découper le gène en cassettes de 200 bp, flanquées de sites de restrictions courants, et si on veut faire des mutants, il suffit juste de changer la cassette par une nouveau fragment de synthèse.  [...]