• Santé - Bactéries, Vecteur, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

En générale YFG est couplé à un gène rapporteur (qui permet la sélection des plasmides qui intègrent effectivement YFG). C'est souvent un gène de résistance chez les bactéries. Ainsi lorsqu'on place les bactéries qui ont intégré le plasmide dans un milieu avec antibiotique, ce sont celles qui survivent qui on intégré YFG étant couplé audit gène de résistance à l'antibio.  [...] petit détail, la sélection des bactéries par l'ampicilline sert à savoir si la bactérie possède le plasmide, mais cela ne donne pas d'indication si le gène codant la protéine a bien été inséré dans ce vecteur.  [...]

Problème sélection kanamycine

J'essaie de sous cloner un gène dans le vecteur pADTRACK-CMV, donc un plasmide avec deux ORF, mais surtout une résistance à la kanamycine. Malheureusement jusqu'à maintenant j'obtiens toujours des tapis complet de colonie absolument partout et surtout même dans mes controles ne contenant que des bactéries (non transformées.  [...] J'ai déja envisagé la température et j'ai donc testé à la température minimum possible, j'ai testé 3 antibio différent, j'ai également testé mon milieu SOC uniquement sur les boites et cela vient vraiment des bactéries elles mêmes. J'ai testé des HB101 qui elle semblent ne pas être résistantes. Je vais donc continuer avec ces bactéries.  [...]

[Biologie Moléculaire] cellules compétentes DH5a

Si ca se trouve vous avez une contamination de votre environnement (pipettes) avec un vecteur qui transforme vos bactéries à votre insu (de très petites quantités de plasmide suffisent à transformer).  [...] le vecteur possede un gene de resistance a l'ampicilline et apporte donc la resistance à l'ampicilline quand il transforme une bactérie DH5a. Or si la bacterie est deja resistante a l'ampicilline avant la transformation, tu ne peux pas distinguer les bactéries transformées des bacteries non transformées resistantes à l'ampicilline.  [...]

ADN recombinant et plasmide

Lorsqu'on fait une expérience de clonage comme celle que tu vois sur la diapo, le plasmide n'est pas retiré d'une bactérie. C'est un vecteur que l'on a en stock dans nos labos (et que l'on achète à des sociétés qui les produisent souvent) et qui permet d'insérer le fragment d'ADN qui nous intéresse pour le multiplier en grande quantité dans des bactéries (généralement des Escherichia coli ).  [...] Par définition, les plasmides ne sont pas essentiels contrairement aux chromosomes. On peut les enlever des bactéries par curage par exemple et ça ne les empêche pas de vivre normalement. Ils apportent juste de nouvelles fonctions à l'organisme qui le possède comme des résistances aux antibiotiques, des facteurs de virulence.  [...]

[Microbiologie] transformation

je dois cloner les produits de digestion de la mutagenèse (insert ADN) dans le vecteur PGEX4T1 en transformant les bactéries compétentes DH5± J'ai trouvé des clones sur un milieu 2YT/AMP j'ai fait une miniprep pour extraire le plasmide recombinant simplement sur le gel les produits sont piégés dans le puits j'ai refait la manip à plusieurs reprises je trouve toujours le même résultat avec un smear Aidez moi que devrais je faire.  [...] Ton smear vient des bactéries je pense. Et ce que tu as dans tes puits c'est probablement ton plasmide avec l ADNg de tes bacteries.  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Mais là j'ai un problème. la résistance à la streptomycine se trouve sur le vecteur et non sur l'insert. Donc dans ce cas nous sélectionnons simplement les bactéries qui ont un plasmide (avec ou sans insert).  [...] Oui, juste compléter. par la néomycine + strepto, tu sélectionneras les bactéries ayant un plasmide recombiné (on nous demande toujours de faire cette vérification pour être sûr que le plasmide porte bien le gène d'intérêt). Plus intéresant serait de faire une construction avec LacZ à la place du gène de la béta-Lactamase.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- plasmide + ligase...= temoin de religation = plasmide digere mais mal dephosphoryle va se religuer sur lui-meme = integrera les bacteries = presence de + de clones (plasmide non digere + plasmide mal dephosphoryle).  [...] Comme tu l'as dit. plasmide + ligase = voir les plasmides mal digérés, mal déphosphorylés. Si la ligase est mauvaise, un faible nombre de bactéries transformées sera peu représentatif de l'efficacité réelle de la digestion et surtout de la déphosphorylation. On peut alors partir sur une fausse piste.  [...]

[Biologie Moléculaire] compatibilité OriS et Ori de PMB1 dans un même plasmide?

Avec ce vecteur je vais cloner des grand fragment de type YAC et BAC, je me demandais si la présence de OriS et de l'origine de réplication de PMB1 pouvait poser des problèmes dans la transmission du plasmide aux bactéries filles, des pb de recombinaison ou autre.  [...] J'ai obtenu des colonies de bactéries qui ont poussé avec ce plasmide. Ensuite j'ai prcoédé à des recombinaisons chez la levure et j'ai électroporé les YACs extraits de la levure dans des E. coli DH10bêta. Et là j'ai des résultats bizarres, je ne sais pas si je n'ai pas perdu l'insert, car j'avais des colonies positives (criblage pcr) et après une maxi prep, j'ai obtenu de bonnes quantités d'ADN mais plus de réponse par PCR.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

j'ai d'abord utilisé 10ng pour 25µL de bacteries, voyant que cela ne fonctionnait pas j'ai ensuite transformé 100ng de vecteur pour 50µL de bacteries.  [...] Svenn on est bien d'accord, mais visiblement les bactéries se transforment bien et poussent, et le simple vecteur coupé et (normalement) recircularisé ne fonctionne pas. D'ou mon interrogation sur la ligation, et ma suggestion de controler le plasmide seul, linéarisé puis après ligation sur gel.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de culture de bactéries

tu pourais essayer de reprendre tes bactéries dans un milieu différant que du LB (SOC,..) ou les laisser un peut plus longtemps récupérer après l'electroporation dans ton milieu sans marqueur de sélection 1h au lieu de 30minutes au risque de perdre des plasmide.  [...] * tu transformes tes bactéries compétentes avec le vecteur seul et tu étales sur la boîte sélective. Comment faire. tu digères ton plasmide comme si tu allais faire une ligation, mais à la place des inserts, tu ajoutes du tampon (même volume que le volume des inserts) et tu fais une ligation dans les mêmes conditions que celles de ton plasmide + insert.  [...]