• Santé - ARN, Quantité, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Contamination d'ARN par de l'ADN

Le test que je suis en train de réaliser consiste à extraire les ARN totaux d'une souche et de rajouter à l'extraction une quantité de plasmide précise (je précise que je cherche les ARNm correspondant à la transcription de mon plasmide). Cette quantité de plasmide est soit DNasée soit non DNasée puis une PCR sera réalisée directement sur ARN (sans RT), cela me permettra de jauger l'efficacité de la DNase du moins je l'espère.  [...] Les essais ont révélés que la DNase du kit Machery Nagel ne fonctionnait pas assez sur colonne (amplification en PCR du plasmide ajouté pendant l'extraction d'ARN). Dans la notice de cette DNase il est précisé qu'en cas de grosse quantité d'ADN, il faut utiliser la DNase après colonne puis réaliser un clean up.  [...]

quantification sonde HIS

salut, a cause d'un oublie malheureux dans mon manuscript de these je suis en galere. Voila j'ai l'habitude de quantifier mes sondes ARN pour l'hybridation in situ avec une migration sur gel, basée sur l'estimation visuel de la production de sonde par rapport a la quantité initiale de plasmide.  [...] DU genre le signal est X fois plus fort. Ensuite je convertisait le tout en ng/microL/Kb a l'aide d'une formule un peu compliquée dont je ne me souviens plus.   [...]

[Biochimie] Calcul d'une concentration en ADN

Je suis peut être en train de bloquer sur quelque chose de simple mais je ne vois pas du tout comment faire, et pourtant j'y ai réfléchi. On sait également que le plasmide est de 3500pb, mais je ne vois pas en quoi cela nous aide. 3500pb peut-il correspondre à la quantité d'ADN en moles.  [...] Comme on me demande la concentration je présume que je dois d'abord calculer la masse de plasmide ainsi que sa masse molaire, et en déduire la quantité de matière de plasmide, et diviser par le volume. Suis-je ok cette fois ci.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

A chaque étape, pensez à faire migrer 200/300ng du plasmide pour vous assurer que l'enzyme a coupé. En contrôle on fait migrer la même quantité de plasmide non coupé. A la seconde étape vous pouvez aussi éventuellement ajouter du plasmide non coupé que vous digèrerez avec la seconde enzyme.  [...] Ensuite mettez vos ADN de sorte d'avoir grossièrement la même quantité (on parle en quantité pas en masse) des uns et des autres (Par exemple 500ng de plasmide. la photo vous y aidera). Completez si besoin avec de l'eau et là deux écoles.  [...]

[Biologie Moléculaire] Essais luciferase promoteur miRNA

La question que je me pose est la suivante. Etant donne que l'expression des miRNA est differente des mRNA (a priori plus faible), est ce qu'il ne serait pas judicieux d'augmenter la quantite de plasmide promoteur+luciferase dans mon experience (par rapport au protocol pour promoteur mRNA).  [...] Si quelqu'un a deja fait un essai luciferase sur des promoteurs miRNA, je suis interesse pour savoir la quantite de plasmide utilise (par rapport aux autres plasmide transfectes).  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment analyser les résultats de PCR quantitative??? - Page 2

dans le labo ou je viens de débarquer, on me demande de quantifier l'expression d'un gène viral (virus à ARN) en qPCR, il semblerait que la meilleure méthode pour ça c'est la qPCR absolue qui permettrait d'avoir le nombre de copie exacte du gène dans le génome du virus afin de comparer ces résultats au nombre de particules virales derrière.  [...] donc ma question est la suivante. vue que c'est un virus à ARN, faut-il cloner le gène dans plasmide et réaliser un courbe de dilution ou bien existe-il une autre méthode si parmi vous une personne a eu a faire un travail similaire, je suis ouvert à toutes vos suggestions et enfin, est ce que quelqu'un parmi vous disposerait d'un protocole à suivre afin de réaliser cette quantification.  [...]

[Biologie Moléculaire] Calcul d'unités enzymatiques

Je dois calculer la quantité théorique d'enzyme de restriction Bam HI et Hind III a utiliser pour digérer 1 microgramme de plasmide pSK et 1microgramme de plasmide pCR-gai ds les conditions standards.  [...] Je connais la définition d une unité d'enzyme de restriction mais je ne comprends pas comment interpréter 1microgramme d'ADN du phage lambda alors qu'on nous donne 50kpb... Y a t il une conversion a faire.   [...]

[Génétique] Analyse plasmides recombinants/non recombinants

Concernant ta question du puit 6, je serait presque pret à parier que ce que tu vois est ton plasmide B (donc ta matrice) mise en trop grande quantité. Ca ressemble à du plasmide et comme ni ta pcr dans le puit 5 (tu as parlé d'une erreur de manipulation) ni dans le puit 7 (pourquoi) n'ont fonctionné, je serait tenté de dire qu'aucune de tes PCR n'a marché malheureusement.  [...] Le probleme c'est que pour le puits 6 je ne sais pas quoi déduire... Pourquoi y a t il 2 bandes La bande a 3000 correspondrait à un excès de plasmides non recombinants et la bande a 6000 mon plasmide contenant l'insert Le soucis c'est que quand j'ai lysé les bactéries, je n'en n'ai vu aucune de bleue dans le culot contrairement à l'échantillon A.  [...]

a l'aide : double hybride en levure!!!!

Q.quantité d'ADN utilisée lors de la cotransfo (en µg). Attention, il s'agit de la quantité de plasmide limitante (par exemple si tu as mis 5 µg de plasmide appât et 2 µg de plasmide de la banque, Q=2).  [...] Exemple.J'ai transformé 15 µg de ma banque avec 5 µg de mon plasmide appât. j'ai donc Q = 5. J'ai resuspendu ma co-transfo dans Vtot = 10 mL. J'ai pris 1 µL de la co-transfo, que j'ai mis dans 99 µL de milieu adéquat. ça me fait donc une dilution au 1/100 que j'étale sur ma boîte de Petri (en schématisant rapidement).  [...]

[Biotechnologie] Concrètement c'est quoi une banque d'ADN

banque d'ADN, quand je vois ça j'imagine un grand institut avec des jolies baies vitrées et plein des scientifiques en blouses blanches qui viennent retirer des séquences d'ADN de leurs banque.   [...] Sachant que ce vecteur se divise en même temps que la cellule, la quantité de plasmide dans une cellule est donc trèèès faible ce qui évite toute recombinaison de plasmide entre eux.  [...]