• Santé - Amplification, Fragment, Génome

[Biotechnologie] calcul du nombre de cycles PCR

J'ai un gène y de 400pb dans un génome de 2.10e6 kb. Combien de cycles d'amplification PCR dois-je effectuer pour obtenir 5µg de ce fragment à partir de 500pg de ce génome.  [...] En admettant que le nombre de copies d'ADN est doublé à chaque cycle (ce qui est une approximation ne tenant pas du rendement de la réaction) vous devriez pouvoir trouver une formule vous permettant de calculer le nombre de cycles PCR à effectuer.   [...]

[Biotechnologie] Amplification par PCR

Par ailleurs, Pourquoi voulez vous créer des amorces qui ne soient pas entièrement spécifiques du fragment d'ADN que vous souhaitez amplifier La probabilité de rencontrer une base est de 1/4, celle de rencontrer deux bases précises est de 1/4. 3 bases, 1/8 etc.  [...] .. Quelle est la probabilité de rencontrer 6 bases Est-ce fréquent dans un génome de 3.10 9 pb La longueur d'identité de vos amorces par rapport au fragment cible n'est elle pas un moyen d'augmenter la spécificité d'amplification.  [...]

[Biologie Moléculaire] stoffel fragment Taq DNA polymerase

Stoffel Fragment is a modified form of AmpliTaq® DNA Polymerase from which the N-terminal 289 amino acids are deleted. Stoffel Fragment differs from AmpliTaq® DNA Polymerase in that it is more thermostable (by approximately 2-fold), exhibits optimal activity over a broader range of magnesium ion concentration (2 mM-10 mM) and lacks intrinsic 5' to 3' exonuclease activity.  [...] The unique properties of Stoffel Fragment make it especially useful for Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR) or Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) amplification methods, whereby genomic DNA is amplified with a set of short primers of arbitrary sequence.  [...]

[Biologie Moléculaire] Diminution de pb lors de la PCR

Si le temps d'amplification n'est pas assez long pour que la polymérase termine d'amplifier votre fragment, alors vous n'aurez rien. Dés le premier cycle, les fragments seront trop courts et ils ne contiendront pas le site de fixation de l'oligo antisens. Résultat, au second cycle ils ne seront pas amplifiés.  [...] Le plus probable est que vous ayez une amplification aspécifique. Quand vous souhaitez amplifier un grand fragment et que votre PCR peut amplifier, en plus, un fragment aspécifique plus petit, la dynamique de la réaction fait que l'amplification du petit fragment sera privilégiée.  [...]

création de bactéries artificielles

mais des infos concernant la technique de modofication du génome bactérien m'intéressent aussi (j'ai lu récement que des chercheurs Américains avaient inséré un gène à E.coli afin de dégrader le mercure présent dans l'eau ainsi qu'un autre pour produire une molécule qui éviterai que le mercure soit toxique pour cette souche).  [...] Moi j'ai simplement entendu parler de la fabrication artificielle d'un virus par une nouvelle technique d'amplification et de lagation des fragments d'ADN. Une fois synthétisé ce génome virale etait injecté dans une cellule et il a permi la synthèse de nouveaux virions. C'etait aussi craig venter.  [...]

[Génétique] Choix amorces amplification portion ADN

- Si j 'ai un fragment d'ADN à amplifier et que j ai un codon début et un codon stop au milieu du fragment, est-ce que je m'en fiche dans le cadre d'une amplification d'un fragment d'ADN En gros, quand on me demande d amplifier un fragment, c est un fragment, sinon on m aurait demandé d'amplifier le gène.  [...] - Si je n'ai pas de codon ATG ou stop dans mon fragment, dois-je le rajouter dans ma séquence d'amorce ( je crois que je fais une confusion entre l amplification et la traduction du gène).  [...]

PCR : Réaction en Chaîne par Polymérase

Il y a de multiples variantes de PCR pour détecter une mutation. Par exemple, tu prends un couple d'amorce dans lequel une des deux amorces a son extrémité 3' qui s'hybride sur un nucléotide muté ou non. Si tu choisi une amorce spécifique du nucléotide non muté, la présence d'une mutation va empêcher l'hybridation de l'extrémité 3' de l'amorce, et la polymérase ne pourra pas amplifier le fragment.  [...] Un seul fragment d'ADN n'est absolument pas détectable si on effectue une visualisation sur gel après coloration avec du syBRgreen. Il y a nécessité d'avoir une forte amplification du fragment pour qu'il soit bien détectable.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment fabriquer une amorce PCR

Alors voilà, une question qui me titille depuis quelques temps. On me dit en cours que la PCR est un outil formidable car on peut amplifier des séquences choisies en fabriquant des amorces spécifiques. Mais comment fait-on pour obtenir la séquence de bases qu'on veut dans l'amorce.   [...] Par exemple, si vous voulez amplifier la région 500 à 1000 d'un gène, alors vous prenez une amorce s'hybridant du nucléotide 500 au nucléotide 520 (car les amorces que l'on utilise font le plus souvent 20 bases) en orientation sens (même séquence que la séquence codante du gène), et vous prenez une amorce s'hybridant du nucléotide 1000 au nucléotide 980 en orientation antisens (séquence complémentaire à la séquence codante du gène).   [...]

clonage

voila je cherche à réaliser le clonage d'un grand fragment de PCR, 4kb. quelqu'un aurait il une idée pour m'aiguiller. Nous avons deja testé différentes choses mais sans aucun résultat malheureusement. Nous sommes ouverts à toutes propositions réalisables.  [...] Slt, alors oui amplification avec bon rendement du fragment désiré. purification ok avec un bon rendement égalment. Ensuite on a digéré le fragment PCR et notre plasmide avec les memes enzymes. On a testé différentes choses mais rien n'y fait. On n'obtient pas de clones satisfaisants.  [...]

[Biologie Moléculaire] probleme avec ma PCR

Ba si y en a pas assez tu peux avoir une amplification mais tu le vera pas sur le gel. En plus si c'est de l'ADN génomique, ta concentration est élevé mais ton nombre de copie beaucoup moindre. Et inversement, petit fragment avec concentration identique, sa fait beaucoup de copies... Tu est à combien en MgCl2.  [...] Ensuite tu peux ajuster ta PCR. nb de cycles, faire un gradient de temperature pour l'hybridation, augmenter ou diminuer le temps d'élongation en fonction de la taille de ton fragment à amplifier, modifier ton tampon de reaction.  [...]