• Santé - Amplification, Enzyme, Restriction

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

L'amplification par PCR va donner des amplicons non méthylés (et aussi ne contenant plus ta cassette vu que l'amplification du vecteur exclura la cassette). Tu ajoutes à ton produit de PCR l'enzyme DpnI qui va cliver l'ADN méthylé en fragments de quelques centaines de bases (enzyme de restriction reconnaissant un site de 4 bases méthylé).  [...] Ainsi, seul ton vecteur d'origine (celui contenant ta cassette) sera digéré par cette enzyme, et pas ton produit de PCR, ce qui te permet de bien te débarrasser de ta cassette.Cela pourrait être une stratégie de rechange par rapport à ta stratégie actuelle qui est de simplement extraire la cassette avec des enzymes de restriction correspondant à ton futur site d'insertion.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR de clones

Tes conditions de PCR sont peut-être limites et ne permettent pas une amplification 100% mais dépendent d'autres variables inter-manips. Tu es sûr de chacun de tes réactifs.  [...] J'ai peut-être une idée mais bon. mes vecteurs ont peut-être une forme super enroulée empêchant leur amplification Je vais tester une enzyme de restriction pour voir si c'est ça ou pas. Qu'en penses-tu.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination d'ARN par de l'ADN

Après votre PCR, procédez à une digestion enzymatique de vos produits par l'enzyme de restriction DpnI. L'intérêt est que cette enzyme coupe un site de 4pb (donc très fréquent) uniquement quand celui ci est methylé. Du coup vous coupez le plasmide qui a été méthylé lors de sa production en bactérie mais pas vos produits PCR.  [...] Je ne pense pas que digérér par DpnI après l'amplification soit utile dans la mesure ou il s'agit d'une RT PCR, possiblement contaminée par de l'ADN génomique, et non de l'amplification d'un ADN venant d'une bactérie. Ceci dit, si tu soupçonnes un problème de DNAse, tu peux prédigérer tes échantillons par une enzyme de restriction (avant de faire la PCR).  [...]

Lire un test HIV

En effet dans le cas d'une recherche d'antigene, tu utilises un anticorps primaire qui le reconnait, puis tu utilises un anticorps secondaire, qui reconnait ton anticorps primaire. L'anticorps secondaire etant couple a une enzyme qui va reagir avec son substrat et te donner la coloration mesuree par la densite optique.  [...] Comme plusieurs anticorps secondaires se fixent en meme temps sur l'anticorps primaire tu as une amplification du signal, enzyme l'enzyme va degrader plusieurs molecules de substrat (re-amplification du signal).  [...]

la taq polymérase????

En 1990 1 enzyme appelée taq-polymérase fut élue molécule de l'année.Cette enzyme, une ADN-polymérase d'origine bactérienne a en effet permis l'élaboration d'une technique révolutionnaire d'amplification de l'ADN. La PCR(réaction de polymérisation en chaîne.).  [...] La PCR est utilisée dans des domaines variés. diagnostic des maladies génétiques, détection des infections virales, médecine prédictive et recherche des empreintes génétiques. Elle pourrait servir à copier en de nombreux exemplaires des fragments d'ADN de mammouth congelés vieux de 40 000 ans ou de restes humains de 7500 ans trouvés dans une tourbière, milieu où la décomposition de la matière organique est très lente.   [...]

test de paternité

Amplification du locus par PCR (à priori par l'enzyme taq polymérase,les amorces étant le plus important pour cibler la séquence intéressante).  [...] Digestion du produit par l'enzyme de restriction (qui varie suivant la squence qui nous intéresse).  [...]

[Biologie Moléculaire] Gros problème.....

Nous avons designé des amorces à partir de ces clones et nous avons décidé d'utiliser une enzyme fidèle pour l'amplification (la Pfx).  [...] Car en partant de si peu d'ADN, tu risques de devoir augmenter ton nombre de cycle (d'ailleur t'es a combien de cycle d'amplif), ce qui est génant car dans ce cas la proba d'une mutation ponctuelle augmente.   [...]

[Biochimie] problème de restriction avec RsaI

j'ai des problèmes avec une PCR suivie d'une restriction avec RsaI. Alors que j'ai des produits d'amplification après la PCR, je ne vois plus rien sur mon gel après la restriction. Je ne comprend pas comment l'action de RSAI pourrait complètement dégrader mes ADNs au point que je ne vois plus rien sur mon gel.  [...] Faut pas s'étonner, RsaI reconnait des palindromes de 4. Si tu connais ta séquence, tu peux vérifier le nombre de sites de restriction mais il doit y en avoir pas mal. Ca peut expliquer pourquoi tu ne vois rien.  [...]

Problème de digestion enzymatique

4- Vos recombinants sont issus de purif sur gel d'amplification PCR Beaucoup de possibilités. vous n'avez pas sélectionné la bonne bande sur gel, ou alors vous êtes planté dans les amorces de PCR, expliquant l'absence d'un site normal de restriction.  [...] Envoyez votre protocole en entier, détaillé, carte de restriction du fameux plasmide comprise, si vous le désirez, je verrai si je vois un truc qui saute aux yeux.  [...]

[Biologie Moléculaire] les enzymes

Cette enzyme, une ADN-polymérase d'origine bactérienne a en effet permis l'élaboration d'une technique révolutionnaire d'amplification de l'ADN. La PCR(réaction de polymérisation en chaîne.).  [...] - une de ses particularités est qu'elle agit à de hautes températures. Normalement les enzymes ne fonctionne que a des températures compatible à la vie soit 37C°.  [...]