• Santé - ADN, Séquence, Vecteur

ADN de séquence inconnue, choix des enzymes de restriction.

Supposons que l'on veuille insérer un brin d'ADN de séquence inconnue dans un vecteur, comment fait-on pour choisir les enzymes de restriction idoines pour couper ce brin d'ADN au bon endroit (c'est à dire à ces deux extrémités, pour pouvoir cloner le brin d'ADN dans son intégralité).  [...] En effet j'ai oublié de le préciser, d'après mon enseignant, il s'agit la d'un produit issue d'une migration électrophortique d'origine inconnue (la belle affaire). Il a illustré sa question par l'exemple d'un chercheur ayant découvert un nouveau gène (produit d'une électrophorèse) à nombre x paires de bases, de plus il à exclu d'emblée la présence de quelconque correspondance dans les bases de données génomiques (encore mieux).   [...]

exercice de génomique assez complexe..

Quels seraient les sites de clonage susceptible d'insérer cette séquence d'ADN, parmi les site de clonages suivants, qu'on supposera présents chez un vecteur quelconque.  [...] Puis ensuite voir si tu peux mettre ta séquence d'ADN digéré, c'est à dire sans les morceaux sur les côtés, après (ou avant, suivant comment on se place) les /.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide ligature

les questions precedentes portent sur la coupure par BgIII d'un fragment d'adn, de la digestion d'un plasmide avec BamH1, et de la sequence obtenue apres ligation au niveau des jonctions vecteur/insert et insert/vecteur. la question est. Ces jonctions peuvent elles etre recoupées par BamH1 et/ou BgIII.  [...] Je ne vois absolument pas comment répondre, logiquement oui elles peuvent recoupées car les jonctions sont des sequences auxquels correspondent les enzymes BamH1 et BgIII, mais ca me semble bizarre... Y a t il un élément de cours qui m'echappe Merci beaucoup d'avance et bonne soirée a tous.  [...]

comment cloner une enzyme extraite d'une cellule animale?

j'ai purifiée une enzyme à partir des cellules d'un insecte dont le génome n'est pas séquencé et je voudrais réaliser le clonage de cette enzyme. Pouvez-vous m'aider concernant la démarche à suivre merci d'avance pour vos réponses.  [...] Voilà, mais dans ces deux cas, obtenir la séquence complète peut être difficile (il faut quand même assez de produit et c'est assez cher)... d'où mon insistance pour obtenir un fragment n-ter et rétrotranscrire, puis amplifier via un polyT et ton amorce spécifique N-ter, cloner dans un plasmide et hop là (en espérant que l'ARN messager soit bien rétrotranscrit, et que la PCR se passent bien...).  [...]

[Biologie Moléculaire] Détection d'une protéine

j'ai ensuite séquencé mes produits d'amplification (amorces dessinées spécifiquement en 5' et 3' de mon insert) pour vérifier que mon insert était correct et surtout entier. Et là, problème ma protéine est tronquée de 4nulcéotides... (sans doute dû à une mauvaise hybridation de mon amorces et donc mauvaise amplification.  [...] Sinon pas le choix, faut refaire le clonage. S' il y a encore des sites de restrictions uniques en 3', il est possible d'y cloner une séquence composée de 2 longs oligos hybridés codant pour une étiquette, mais ca ne me semble pas beaucoup plus simple que de recommencer malheureusement.  [...]

transgenese

C'est aussi le vecteur qui, par sa propre construction (exemple, présence de promoteurs forts), pourra assurer ou contrôler l'expression des gènes clonés (vecteurs d'expression).  [...] L'ADN nu contenant la séquence thérapeutique est injecté sous forme de plasmide bactérien dans le tissu cible. Il est ensuite intégré dans les cellules par des mécanismes encore inconnus.  [...]

Intégration dans un plasmide

L'intégration de séquence d'intéret ( un ou plusieurs gènes ) se fait par technique d'ADN recombinant. En gros, tu vas utiliser des endonucléases ( ou enzymes de restriction) qui font créer des extrémitées cohésives ( pouvant être ligasé par une ADN ligase ) sur ta séquence d'intérêt et sur ton vecteur plasmidique.  [...] Une fois que tu as digéré avec tes endonucléases, tu peux procéder à la ligation de ton vecteur (le plasmide) et de ton insert (ta séquence).  [...]

soutern, PCR, banque genomique

UNe banque génomique, c'est une collection de vecteur ayant chacun intégré un morceau d'ADN génomique, par exemple après digestion à completion de ce dernier. Le passage en vecteur permet d'amplifier ce morceau (notamment quand ne connait pas la séquence, alors qu'on amplifie en PCR quand on la connait en général) et donc de le stocker (conservation), et de l'analyser (restriction, séquencage depuis une amorce située sur le vecteur).  [...] La PCR ne peut amplifier que quelques centaines de paires de bases. Pour une séquence plus importante, il faut l'amplifier en l'incluant dans un vecteur qui pourra être cloné en même temps que l'hôte qui le recevra. Si la séquence est vraiment trop grosse, il faut la diviser et inclure les portions dans des vecteurs pour constituer une banque.  [...]

transgenèse

- Vecteur désarmé. vecteur de gènes auquel on a enlevé son pouvoir pathogène (ex. plasmide de la bactérie Agrobacterium tumefacies dont les gènes de virulence responsables de la galle du collet ont été retirés).  [...] Ben j'ai répondu pourtant. C'est un vecteur, donc un système porteur d'une séquence d'adn destinée à être transférée dans un autre organisme. Mais ce même vecteur peut-être utilisé pour le clonage, c'est-à-dire qu'il est capable de se répliquer dans une bactérie E.  [...]

[Génétique] Notion d'insert et de vecteur

J'ai eu une seance de TD de genetique avec des exercice concernant ces notions mais je n'ai pas eu de cours auparavant, et mon professeur est flamand et sans etre mechant, malgres mes questions impossible d'obtenir une reponse que je puisse comprendre.   [...] En générant les même extrémités au niveau de l'insert, celui ci pourra s'apparier avec les extrémités du vecteur car si tu remarques ce sont des séquences dites palindromiques. la moitié 5' de la séquence est complémentaire de la moitié 3'. Une fois collé, on reconstitue un fragment d'ADN circulaire avec l'insert inséré.  [...]