• Santé - ADN, Plaque, Puits

[Biologie Cellulaire] Triple transfection

De même, je pense qu'il faut utiliser un même nombre de chaque plasmide (en tenant compte de leur taille respective) plutôt que de mettre par exemple 4ug de chaque (je bosse en plaque de 6 puits).  [...] Et en effet mettre le même nombre de plasmide est mieux que des quantités d'ADN arbitraire surtout si tes plasmides sont vraiment différents en taille. Veille aussi à ne pas dépasser la quantité maximale d'ADN à transfecter dans chaque puits (qui est la même que pour une transfection simple).  [...]

[Biologie Moléculaire] transfection lipofectamine LTX and PLUS reagent invitrogene

Pour 100µL de milieu de transfection (ADN-lipo-Plus reagent dans de l'opti-MEM), je te conseille d'ensemencer tes cellules la veille dans 1mL de milieu (si tu cultives en plaques 24 puits, à adapter sinon) de manière à ce qu'elles soient à H80% de confluence le lendemain, puis le lendemain pendant l'incubation de tes complexes, de laver ton puits avec du PBS, de remettre 400µL de milieu de culture sans serum puis d'y rajouter tes 100µL de milieu de transfection (limiter le volume pendant la transfection permet de réduire le temps que mettront les liposomes pour sédimenter).  [...] Pour optimiser ta transfection, essaie de faire varier ta quantité de Lipo (par exemple 1µL, 2µL et 4µL par puits de plaque 24 puits) et ta quantité d'ADN (250ng, 500ng, 1000ng). Si tu as les meilleurs résultats pour 1µL de lipo, essaie avec 0.5µL etc.  [...]

[Génétique] qPCR taqman

Bonjour, je dois faire des qPCR en taqman et je dois déposer 2,5µl d'ADN dans une plaque de 96 puits suivit de 7,5µl de mix pour un volume final de 10µl dans chaque puit. Or, j'ai peur de ne pas déposer les mêmes quantités vu que ce sont des quantités très minime, donc ma question est la suivante.  [...] Si je crée une marge et je dépose 2,6 d'ADN et 7,6 du mix tout en cochant 10µl de volume final dans le logiciel, est-ce que cela va changer quelque chose au niveau des résultats Est-ce que cela pourrait altérer la fiabilité des résultats que j'obtiendrai merci.  [...]

[Biologie Moléculaire] qPCR

Si on veut amplifier d'une part de l'ADN et d'autre part de l'ARN, serait-il envisageable de n'utiliser qu'une seule plaque PCR. de faire l'étape de rétro transcription sur la plaque entière (avec la rétro-transcriptase seulement dans les puits avec ARN) et ensuite faire l'étape d'amplification sur la totalité de la plaque.  [...] Oui c'est possible, Applied Biosystem (entre autre) vend un kit qui permet de faire la RT et la qPCR dans la foulee. Par contre melanger sur une plaque de l'ADN et de l'ARN ca c'est pas terrible... tu risques d'avoir des contaminations ADN a la pelle.  [...]

[Biotechnologie] Culture bactérienne et protéines recombinantes en plaque 96 puits

Mon problème est le suivant, si je fais des test d'expression en format plaque 96 puits, comment séparer la fraction soluble et insoluble après la lyse bactérienne...car je ne possède pas de centri/rotor permettant de faire tourne une plaque 96 puits à une telle vitesse (15000g).  [...] Existe t-il un système permettant de séparer les fractions solubles/insolubles directement en plaque 96 puits. Est ce qu'il y a des utilisateurs qui ont l'habitude de faire de la production de protéines recombinantes en plaques.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème culture cellulaire HEK293 en plaque 96 puits

Je travaille actuellement avec des HEK293 que j'ai repiquées en plaque 96 puits dans le but de faire un MTS. 24h après le repiquage (~10000 cellules/puits), mes cellules apparaissent adhérentes, belles et bien éparpillées dans le puits mais peu confluentes (20% grand max).  [...] La seule solution potable que j'ai trouvé c'est d'incliner ma plaque 96p à l'opposé de moi (donc vers le fond de ma hotte) et de poser les tips inclinés le long de la paroi des puits (le haut de la pipette étant orienté vers le fond de la hotte). Et surtout de déposer ma solution très très très très doucement.  [...]

[Immunologie] ELISA coating et conservation

Je dilue 1 000 fois mon anticorps avant utilisation, je mets 200 µL dans chaque puits, j'incube (selon le moment où je veux récupérer les plaques) soit 3h à 37 °C, soit 4h à 27 °C, soit toute la nuit au frigo (4 °C).  [...] Je viens de lire. lavage par trempage. Ce qui voudrai dire que tu immerge ta plaque dans ta solution de tween Si c'est le cas, c'est pas super top comme méthode. Si tu n'as pas d'automate de lavage, tu peux toujours remplir tes puits avec ta solution, les vider en essayant de ne pas transférer de solution d'un puit à l'autre, puis de taper ta plaque contre du papier absorbant pour sécher les puits aux maximum.  [...]

[Biologie Moléculaire] Résultats de PCR

me revoici avec encore un problème de PCR. J'ai préparé des plaques PCR 384 d'ADNc avec un témoin négatif d'eau RNAse free présent dans 96 puits répartis régulièrement sur toute la plaque. J'ai passé ces plaques en PCR à raison d'une tous les 2 jours. J'ai ensuite lancé ma PCR sur le light cycler 480 de ROCHE.  [...] Mes questions sont donc. d'où viennent les Cp et les Tm de mes témoins négatifs Est-ce-que ça peut être une contamination Est-ce que cette contamination peut être due au robot qui m'a servi à distribuer les plaques (sachant que les puits concernés ne sont pas les mêmes d'une plaque à l'autre).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème PCR : Besoin d'aide

soit l'étape de synthèse de l'ADNc déconnait et je me retrouvais avec rien du tout en qPCR, soit la qPCR elle-même crashait pour je ne sais quelle raison... Je crois que ce serait dû à la protéinase K dans certains cas, à la petite quantité d'ARN viraux dans un autre (plutôt la très grosse quantité d'ARN eucaryote gêne...).   [...] Bonjour, SVP j'ai fait ce matin une PCR Taqman sur une plaque à 48 puits avc un assay dattant de 2ans au congélo sachant que ça a déja marché y a qq mois sur d'autres ADNs et pareil pr le master-mix for genotyping et le prblm c que j'ai eu des résultats vraiment bizarres ç à d.  [...]

[Biologie Moléculaire] Séquençage à très haut débit

et du coup, je comprends bien qu'on amplifie l'ADN dans chaque puits car il était fixé à une bille qui passe dan sce puits, en revanche, comment fait-on pour conclure ok on voit de la lumière dans certains puits et pas dans d'autres, mais que cela signifie-t-il.  [...] L'enchainement de l'incorporation des nucléotides et la prise d'image à chaque étape permet à la machine de reconstituer la séquence contenue dans chaque puits.  [...]