• Forum - Western, Protéine, Membrane

[Biologie Moléculaire] Western sur protéine membranaire

Je cherche a effectuer un western sur un extrait de protéine de levure (donc difficile a casser). cette protéine a la particularité d'etre accrochée et retenue a la membrane vacuolaire (ainsi qu'au RE).  [...] Je fais tous mes western sur une protéine membranaire (mais de cellules humaines et pas de levure) en Laemli (je n'ai jamais su l'écrire) ou d'autres tampons style Guanidium, urée, RIPA,... Ca ne marche pas le Laemli chez la levure Est ce que tu as essayé de casser au dounce.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.. Je sais plus quoi faire.  [...] Mon problème en ce moment c'est qu'après le transfert sur membrane mes bandes de protéine sont coulantes comme si on les avait frottés tout comme les bandes du marqueur de poids moléculaire.  [...]

[Biochimie] Différence western blot / immunoprécipitation

Ensuite on peut mettre la protéine isolée sur un gel d'électrophorèse puis une membrane pour révéler sa présence (ou non) avec un anticorps.  [...] Ce sont deux techniques qui n'ont absolument rien à voir. Le Western Blot consiste à révéler la présence d'une protéine sur une membrane grâce à des anticorp, tandis que l'immunoprécipitation consiste à isoler une protéine -éventuellement en complex avec d'autres protéines/RNA/ADN - à partir d'un lysat.  [...]

[Biochimie] Modifications post traductionnelles et électrophorèse !

Moi je serai toi je transfererai longtemps (quite à mettre deux membranes supperposées si tu veux aussi voir des protéines plus petites qui risques de passer à travers la première). Et j'utiliserai éventuellement une membrane avec une taille de pores plus importante (que le 0,2µ classique).  [...] Tu as une partie de ta protéine de 60kDa qui reste sur ta membrane mais si tu mets une deuxième membrane derrière et que tu fais ton western tu verras qu'il y en a autant sur la deuxième, sinon plus^^.  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunohistochimie/ Immunomarquage

De ce que je me rappelle les deux termes évoquent la même chose. Et le test ELISA en est un bel exemple. On peut mettre en évidence la présence d'une protéines, Ag, etc... d'intérêt à l'aide d'anticorps primaire, secondaire couplé à une enzyme dans le cas de l'ELISA.  [...] Dans le cas d'un western blot, c'est +/- le même principe détection à l'aide de deux anticorps sauf qu'on agit sur une membrane. Après avoir fait migrer ta protéine sur une membrane, tu la détectes à l'aide d'anticorps primaire et secondaire. Cependant cette technique est bien plus fastidieuse.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot /tampon de transfert

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.  [...] Pour répondre au dernier message, pour ma part lors des transferts de ma protéine de 26kDa que je faisais sur membrane PVDF avec le même tampon ou très très proche. Je ne dépassais pas les 25 V mais pendant 50 minute-1h. Maintenant, je t'avoue je n'ai jamais essayé autant de volt et temps pour un transfert.  [...]

[Génétique] Adn

voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une menbrane pour un test de type western. sachant ke la formulation de ce tampn est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( ja i reponde a la kestion) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...] voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une membrane pour un test de type western. sachant que la formulation de ce tampon est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( j'ai deja repondu a cette question) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...]

[Biologie Moléculaire] analyse southern et northern blot

Voila, j'ai un peu de mal à interpréter les résultats de l'étude d'un gène par hybridation sur membrane. j'étudie une anomalie de production d'un facteur de croissance chez les chats siamois. On a donc réalisé successivment un Southern, un Northern et un Western ( avec la protéine).  [...] Le problème, c'est qu'en western, chez un individu malade on observe aucun signal...pas d'hybridation avec la protéine. Je n'arrive pas a comprendre comment a partir des mêmes ARNm on obtient des protéines différentes.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot / proteine hrp

Et cela en faisant bien sur un western sans sds afin de ne pas dénaturer les proteines pour pouvoir révéler la peroxydase sur la membrane.  [...] Je ne comprends pas bien. On peut tout à fait faire un western avec SDS et utiliser un anticorps couplé à la péroxydase. Le SDS agit pendant la migration mais une fois que les protéines sont sur la membrane, il n'y a plus de SDS et si il en reste il disparaît avec les lavages donc aucun problème pour la péroxydase (et d'ailleurs intuitivement ça coule de source car les anticorps que vous allez utiliser, avant la péroxydase, nescessitent leur conformation 3D ce qui prouve que le SDS ne bouleverse pas la manipe une fois que l'on est sur la membrane).  [...]

[Biochimie] bandes parasites aprés révélation western-blot

mon éluat final d'IP contient l'Ac que j'ai utilisé pour réaliser mon IP et bien sur ma protéine d'intérêt, je réalise ensuite un SDSpage et un western sur la nuit, je révèle mon blot à l'aide de l'Ac que j'ai utilisé pour mon IP ainsi qu'avec un Ac-HRP dirigé contre mon Ac d'IP, je bloque la membrane avec lait écrémé 3%.  [...] apré révélation du blot à l'opti 4CN (biorad) je retrouve bien ma protéine d'intérêt (IP fonctionne) ainsi que la bande haute et basse de mon Ac spécifique de ma protéine, mais si je laisse le blot révélé plus longtemps, je vois apparaitre d'autres bandes autour de celles de l'Ac (révélation du blot ~2min) ces bandes sont elles dû à un mauvais blocage de la membrane utilisation d'un Ac-HRP polyclonal comme Ac secondaire.  [...]