• Forum - Voltage, Bandes, Migration

[Biologie Moléculaire] Page sds

plus le voltage est élevé, la séparation des bandes est rapide mais lors de la révélation la séparation des bandes sera moins nette. Pour certains protocoles nous réalisons des migration à faible voltage durant plusieurs heures.  [...] Je n'ai jamais été un pro des migrations longues durées, mais dans le cas de grosses protéines, je réaliserai un migration de 6-8h (donc sur la journée) à 80-100V (l'idéal serai que la bande des 250kDa de ton marqueur de taille soit au milieu de ton gel). Tu va donc faire sortir du gel toutes les protéines de faible poids moléculaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Migration SDS page en "sourire"

1) Voltage excessif. La chaleur perturbe la migration électrophorétique. Il faut particulièrement éviter les situations où le gel est soumis à des températures différentes. Les gels en plaque sont particulièrement sensible et il est fréquent que le centre des gels surchauffe si on est trop pressé.  [...] Cela cause une migration plus lente des échantillons des puits périphériques caractérisé par des bandes protéiques ayant migré plus rapidement au centre du gel, créant un patron ayant la forme d'un sourire... Pour assurer un refroidissement uniforme de tout le gel, diminuer le voltage et augmenter la durée de migration.  [...]

[Biochimie] Paramètres western blot

Je migre generalement jusqu'a ce que mon bleu sorte du gel (~ 1h) et mes bandes a haut PM sont super bien separee. Je sais que la meme compagnie vend aussi des gels specifiques pour les grosses proteines.  [...] L'important n'est pas le voltage pour séparer les deux bandes mais la distance de migration. Le voltage est surtout important pour la résolution des bandes. Je faisais arriver la bande de 60 kDa du marqueur de taille à 1 cm du bas du gel car j'avais une protéine à 60 kDa qui m'intéressait.  [...]

Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

Dans la littérature, on trouve que les nombreux résidus acides (dont la sérine), pourraient etre responsables de cette migration aberrante dans un gel SDS-page. Cependant, je n'arrive pas à trouver plus d'info sur le Pourquoi de cette migration aberrante.  [...] Cette observation en western blot s'est faite à plusieurs reprises, que ça soit dans mon travail (pour des migrations à plus haut ou plus bas voltage), ou dans d'autres papiers. Je doute que ça soit un question de problème de migration, de dénaturation, ou encore SDS et de charge négative.  [...]

[Biologie Moléculaire] le gel idéal??

Pour la migration je l'ai laissé à 100 volts durant 30 minutes environs (protocole) et pour la camera, je fais avec les moyens du bord.  [...] ... Donc ton ADN migre mais très lentement. Dans ce cas soit on passe à un pourcentage en agarose plus faible, soit on augmente le temps de migration. On peut augmenter le voltage mais sur de longues durées ça chauffe trop, ça peut causer des changements de migration.  [...]

[Biochimie] Sds page

Enfin, avez vous un moyen afin de voir le nombre d'ampère que le générateur délivre (car les gels se foont généralement à voltage constant et ampérage flottant), et enfin, un moyen de vérifier la puissance distribué par le générateur (et voir si celle-ci varie fortement pendant la migration).  [...] De manière plus pratique, le voltage va déterminer la vitesse de la migration des protéines (et ions) dans le gel. L'ampérage lui indique la résistance électrique qu'impose le gel (et également la chauffe du matériel). Si il n'y a pas d'ampère détecter (ce qui ne veut pas dire qu'il n'y en a pas), le matériel n'est pas/peu conducteur.  [...]

[Biochimie] Migration Western Blot - Page 2

J'avoue que lors des migration je ne regarde pas vraiment l'ampérage mais ma collègue à le même système de cuve et on partage les générateurs et elle n'a pas ces soucis.  [...] en tension constante ton intensité varie aussi vu que la résistance n'est pas constante. La migration doit aller de moins en moins vite, non.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

C'est ce qu'on veut d'ailleurs montrer en traitant les cellules différemment). J'ai alors acheté des gels commerciaux de chez BioRad ( 10%). J'ai suivi leur protocole de migration (200V pendant 45 min), j'ai fais le semi dry transfert à 25V pendant 2h. Le transfert a été parfait car mon marqueur de poids moléculaire de 300kda a été bien transféré.  [...] Le dot blot marche donc c'est plutôt bon signe, même si ça n'exclue pas tous les artefacts possibles liés à ton anticorps. S'agit-il d'un anticorps polyclonal ou monoclonal directement dirigé contre ta protéine ou d'un anticorps dirigé contre une étiquette que tu as ajouté Quand tu utilises cet anticorps, tu ne vois pas ta protéine mais vois-tu d'autres bandes plus petites ailleurs sur le gel Si tu vois des bandes plus petites, s'agit-il d'une bande unique (dans ce cas, il s'agit probablement d'une reconnaissance non spécifique d'une protéine qui n'a rien à voir) ou de plusieurs bandes et en particulier de bandes proches les unes des autres (dans ce cas c'est sans doute une dégradation partielle).  [...]

[Biochimie] probleme de migration electrophorèse

Vous avez réalisé une électrophorèse des protéines sériques et vous obtenez après coloration une migration trop courte et des fractions mal séparées. Quels paramètres allez vous modifier pour améliorer la technique.  [...] J'ai plusieurs idées de facteurs qu'on pourrait modifier pour modifier une électrophorèse. le pH du tampon, la force ionique, le voltage, l'intensité du courant, la durée de migration.  [...]

[Biologie Moléculaire] Meilleure résolution pour gel d'agarose

On arrive enfin à ma question. comment je pourrai faire pour améliorer la discrimination de mes bandes sur mon gel J'ai testé de passer de 1% d'agarose à 0.8%, c'est un peu mieux mais pas mirobolant. Des idées Sachant que je fait migrer 5min à 70V puis 25/30min à 150V. Si je diminue le voltage, ça sera mieux.  [...] La dernière solution, c'est faire le combo des deux précédentes. Avec 10 cm de gel à 2% et une bonne migration, il est possible de séparer 500 et 550 pb sur un gel. Donc 1200 et 1400 doit également être possible.  [...]