• Forum - Vecteur, Séquences, Fragments

[Biologie Moléculaire] séquençage ADN

Je séquence directement mon produit PCR. Je pourrais l'integrer dans un vecteur mais cela prendrais trop de temps car je n'ai pas seulment ce fragment (un exon) à sequencer mais j'ai 50 autres exons du coup je m'imagine vraiment pas faire 50 clonages. Par contre j'ai entendus dire que séquencer à partir de vecteur c'etaies beacoup plus jolies au niveau des séquences donc peut être que sa vaut le coup de le faire pour certains fragments.  [...] Voilà. A mon avis si tu as des soucis de séquencage pour certains fragment ca peut être une manière d'avancer. C'est sur que si tu as plein plein de séquence ca peut devenir pénible.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR quantitative

En principe, tu devrais connaître le nombre initial de copies de ta molécule d'intérêt (en fait, du fragment d'intérêt) dans ton échantillon. Tu peux alors en déduire ta quantité de cette molécule en ng.  [...] Comment faire un bon étalon alors Si c'est par dosage qPCR, c'est le chat qui se mort la queue, si c'est pas dosage spectro, cela signifie que ton standard correspond à ta séquence cible pure (fragments de PCR, vecteur contenant la séquence d'intérêt, etc...).  [...]

[Biologie Moléculaire] compatibilité OriS et Ori de PMB1 dans un même plasmide?

Avec ce vecteur je vais cloner des grand fragment de type YAC et BAC, je me demandais si la présence de OriS et de l'origine de réplication de PMB1 pouvait poser des problèmes dans la transmission du plasmide aux bactéries filles, des pb de recombinaison ou autre.  [...] le but c'était de faire des recombinaisons chez la levure et de pouvoir électroporer directement le YAC dans les bactéries. Le vecteur possède 2 ori procaryotes car je l'ai construit en ligant des fragments de deux vecteurs différents (et je croyais avoir supprimé une des 2 oris mais après séquençage elles y sont toutes les deux).  [...]

[Biochimie] Gateway technology

Si je flanque mon produit de PCR avec des sites attB, là je suis obligée de le recombiner avec un vecteur pDONOR, par contre je peux générer des fragments reconnus par des enzymes de restriction et cloner directement dans un vecteur pENTR, ou encore utiliser un pENTR-TOPO il me semble.  [...] Je tombe sur cette discussion 3 ans après mais la je suis dans la meme situation. Avez vous pu réussir votre clonage En effet je dispose d'un système gateway et j'ai des fragments pcr que j'ai envie d'insérer dans mon vecteur d'entrée pENTR1A, mais la carte de ce vecteur est un peu ambigue pour moi.  [...]

[Biologie Moléculaire] La génomique structurale !

Ils ont donc coupé, puis cloné chaque fragments de l'ADN humain (en usant à la fois d'enzyme de restriction et de séquences chevauchantes) dans des vecteurs d'expression standardisé, qu'ils ont fait séquencé (si je me souviens bien, à l'époque, il fallait faire une 20 de run -pas sur du chiffre, si quelqu'un peut confirmer- pour être un peu près sûr du séquençage des 500 premières paires de bases).  [...] Une fois le brin d'ADN séquencé, il suffisait de raccommoder informatiquement le génome grâce au parties chevauchantes. Cette méthode est très rapide (surtout avec des centaines de séquenceur haut débit), mais ils ont eu des problèmes à cause des séquences hautement répétées (type centromère), car impossible de savoir le nombre de répétitions.  [...]

[Génétique] Questions à propos de la thérapie génique

Je n'ai pas vraiment compris la notion de stabilité du vecteur (dans les documents que j'ai trouvé, il est dit que le vecteur doit etre de petite taille car cette petite taille lui assure une certaine stabilité ce qui permet l'insertion de grands fragments d'ADN étranger).  [...] Donc, pour revenir à ta question le vecteur doit etre de petite taille car cette petite taille lui assure une certaine stabilité ce qui permet l'insertion de grands fragments d'ADN étranger, en effet plus le matériel génétique viral résiduel sera petit plus le transgène pourra être grand, mais en ce qui concerne la stabilité.  [...]

Besoin que l'on eclaire ma lanterne en Génetique

VOila et si quelqun a un peu plus de temps, et bien s'ils pouvait mexpliquer rapidement la difference entre les methodes AFLP et RAPD car la seule que j'ai veritablement bien compris est la RFLP qui est assez simple et qui n'est pas un marqueur de type PCR..confused.   [...] Ensuite les aux extrémités des fragments d'ADN obtenus on fixe des séquences cibles. Il ne reste plus qu'à faire une PCR en utilisant des amorces complémentaires des séquences cible.  [...]

[Biologie Moléculaire] Connaitre séquence génomique....

digestion de restriction avec plusieurs enzymes dont les séquences ne reviennent pas trop souvent (digestions simples et doubles histoire d'avoir les fragments avec plusieurs origines et fins différentes.). Tu as une idée de la complexité du génome (tu peux faire des essais pour voir la taille moyenne des fragments que tu rammènes). Tu fais une banque avec tout cela.  [...] Bonjour,pour ne pas recréer un nouveau topic, je poste ici, je voudrai savoir pourquoi on fait un clonage (fragmentation du génome, et incorporation des fragments dans un vecteur et établissement d'une banque génomique...) pour faire un séquençage.  [...]

Question idiote sur le génôme humain

En gros (et vraiment très gros). on tire dans le tas (tas d'ADN) et on séquence les fragments. ensuite avec des programmes, on aligne les fragments et superpose les régions identiques afin de reconstituer la frise.  [...] Le génome dans son entièreté est fractionné au hasard pour obtenir des plus petits morceaux. Comme au départ on a plusieurs molécules d'ADN équivalente, on obtient, après digestion, des fragments dont les séquences peuvent se superposer. Le séquençage est donc redondant.  [...]

[Génétique] Sequençage d'ADN

Alors, il faut bien distinguer deux phases. La première phase est l'amplification des fragments, c'est le même principe qu'une PCR (les primers sont spécifiques à des adapters, séquences qui ont été ajoutées à chaque bout des fragments d'ADN). L'amplification des fragments est nécessaire pour obtenir un signal analysable (bon signal / noise ratio).  [...] La deuxième phase, est la phase qui permet de séquencer les fragments. Certes l'ADN y est aussi amplifié, mais c'est n'est pas le but. Au début de cette phase, on ajoute seulement un type de primers, des dNTP et la polymérase. Les dNTP ont tous un fluorofore sur leur sucre, qui empêche l'ajout d'un autre nucléotide lors de la réplication.  [...]