• Forum - Vecteur, Séquence, Intérêt

[Biologie Moléculaire] PCR quantitative

- Donc en PCRq, on compare notre gène d'intérêt avec un housekeeping gene, ma question est la suivante notre résultat il sort sous quelle forme, en nombre de copies par cycle ou es-ce qu'on peut ramener ça en quantité, ng par exemple.  [...] Comment faire un bon étalon alors Si c'est par dosage qPCR, c'est le chat qui se mort la queue, si c'est pas dosage spectro, cela signifie que ton standard correspond à ta séquence cible pure (fragments de PCR, vecteur contenant la séquence d'intérêt, etc...).  [...]

[Immunologie] Fixation pour immonofluorescence

Par contre ils restent visibles dans les cellules transfectées avec les plasmides contenant mes gènes d'intérets. J'ai peur que les méthodes de fixations utilisées n'entrainent une relocalisation cellulaire de mes protéines.  [...] Je vais surement dire quelque chose de tres tres bete, mais je lisais ce que tu avais ecrit, et qq chose a du m'echapper... Si tu réalise un immunomarquage de tes tag sur vecteur vide c'est normal que tu n'ais pas de marquage nan ton tag etant lié a ta sequence codante, sans sequence codante pas de tag.  [...]

OGM - Clonage d'un gène / Construction du trangène

Nous somme d'accord que le clonage d'un gène se fait par l'intermédiaire d'un vecteur tels E.Coli par exemple afin d'obtenir une quantité de séquences d'intérêts importantes (Notre gène inséré).  [...] Par ailleurs pour créer un OGM il va aussi falloir créer un transgène, c'est à dire notre séquence d'intérêt mais aussi y ajouter un promoteur, éventuellement des séquences régulatrices et tout ca. Mais comment se fait cette étape la Et une fois que l'on a formé notre transgène, il faut de nouveau utiliser un vecteur pour remultiplier notre séquence d'intérêt.  [...]

[Biologie Moléculaire] Programme de clonage

Dans cette fenêtre de construction, il faut ouvrir la séquence du vecteur, choisir les sites de début (simple clic) et de fin (double clic). Faire de même avec l'insert. Blunter si nécessaire et cliquer sur Ligate. Notez que si l'insert est, par exemple, EcoRI (début)/BamHI (fin) alors le vecteur doit être ouvert par BamHI (début) / EcoRI (fin).  [...] J ai vu que lorsque l'on enregistre une séquence on a des options pour entrer les extrémités cohésives, est ce champ là qu'il faut remplir pour obtenir le vecteur sous forme circulaire Auquel cas je n'y suis pas arrivée.  [...]

[Biotechnologie] Plasmide recombinant

2) le plasmide possède systématiquement un gène de sélection (pour vérifier la présence du plasmide) ainsi qu'un gène phénotypique - dit gène raporteur- pour verifier la présence de la séquence d'intérêt dans le vecteur plasmidique.  [...] 6) On doit tenir compte de séquences introns (tel UTR5') nécessaire pour la régulation lorsqu'on produit une protéine dans une cellulemammifères. Ces séquences doivent elles aussi être prises en compte pour les levures et bactéries Les séquence de régulation EUC seront elles donc prises en compte chez le PROCARYOTES.  [...]

clonage

Le clonage sert à placer une séquence d'intérêt dans un contexte génétique bien contrôlé, le vecteur. Je suppose que l'idée est de voir ce qu'il y a avant un traitement, ou une exposition aux protéines TALEN et après afin de caractériser la mutagénèse.  [...] sélection des clones ayant bien reçu le vecteur avec l'insert. grâce a un gène de résistance a un antibiotique et un gène rapporteur car le site d'insertion de l'insert est situé à l'intérieur du gène de la B-galactosidase.  [...]

[Biologie Moléculaire] Recombinaison LR et interférence ARN

Je sais bien comment ça se passe dans le cas classique, mais le problème là est que le vecteur de destination (en l'occurence pK7GWIWG2D (II), à vos souhaits ) contient deux cassettes Gateway indépendantes (attR1-ccdB-attR2) séparées par un intron. Le but est d'introduire deux fois la séquence du gène d'intérêt en tête-bêche.  [...] Je sais que la réaction LR se fait en une fois, mais je ne vois pas comment ça se passe. est-ce qu'il y a une réaction LR séparée au niveau de chaque cassette, avec deux vecteurs d'entrée.  [...]

PCR problème de poids moléculaire

Alors voilà j'ai reçu un plasmide d'un collaborateur contenant une séquence qui m'intéresse. Je dois récupérer cette séquence pour la sous-cloner dans un autre vecteur. J'ai donc designé 2 primers contenant le début ou la fin de ma séquence + un site de restriction enzymatique.  [...] Le problème est qu'après PCR j'obtiens un fragment à environ 3500pb au lieu des 2300 attendues. Après avoir essayé différentes températures d'hybridation, différentes TAQ… j'ai fini par envoyer à séquencer et pas de problème la séquence voulue est bien là… donc j'ai designé de nouveaux primers car les premiers avaient un Tm très différent, et après PCR je retombe encore sur cette bande trop haute + une bande vers 750, comme avec les précédents primers.  [...]

[Génétique] Construire un vecteur de transgenèse dérivé des transposons

J'aimerai avoir quelques explications sur le transposon. Où est ce qu'on le trouve à l'origine Est ce qu'il reconnait toujours la même séquence nucléotidique Quels sont les mécanismes qui lui permettent de faire passer un gène d'intérêt dans un vecteur (plasmide).  [...] Les gènes d'interets du transposon seront les gènes que tu cloneras à l'interieur de celui-ci. gène de résistance pour la plus part des cas. Le clonage réalisé, le transposon sera cloné dans un vecteur non réplicatif pour forcer son insertion chromosomique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Séquences répétées inversées

Pas exactement. Une séquence répétée inversée est contenue dans un vecteur par exemple afin d'inactiver un gène d'un génome. Cette séquence est constitué du gène en question (5'-3') et de la séquence de ce gène mais inversées (3'-5').  [...] Il me semble que la tendance désormais est le système Cre-LoxP qui permet de réaliser cette inversion mais en plus de façon inductible. Il y a aussi le polyA-trapping avec insertion d'une résistance à la néomycine. Ici, on place la séquence d'intérêt par recombinaison homologue au niveau du premier intron, suivi du gène de résistance à la néomycine, suivi d'une séquence de polyadénylation stoppant prématurément la transcription du gène et l'invalidant.  [...]