• Forum - Vecteur, Plasmide, Site, Schéma

transgénèse végétale

Dois-je prendre des primers qui ont un site de restriction bien spécifique pour pouvoir mettre l'ADN amplifié dans le vecteur ti désarmé après Quel doit être la longueur du primer environ.  [...] Le promoteur 35S faut-il que je le clone aussi dans le vecteur ou est il généralement déjà dans les plasmide ti désarmé avec un site polylinker Si quelqu'un connait un site ou il y a un schéma ce serait super.  [...]

[Biologie Moléculaire] "Vectorologie" : le cPPT ?

Dans le vecteur permettant l'expression du plasmide dans les cellules eucaryotes (alternativement il sert aussi à la production des particules), il y a juste après le site d'insertion du shRNA un site appelé cPPT pour central Polypurine Tract.  [...] A retroviral RNA genome contains short stretches of purines, called polypurine tracts (PPTs), near the 32-end. These PPTs function as RNA primers for plus-strand DNA synthesis during reverse transcription. Complex retroviruses (including HIV-1) contain a second, more centrally located PPT that provides a second site for initiation of DNA synthesis.  [...]

[Biologie Moléculaire] Meilleure résolution pour gel d'agarose

J'ai commandé un gène dans un plasmide avec les site de restriction qui vont bien de chaque côté et comme j'ai beaucoup de chance, il se trouve que le vecteur qu'il m'ont envoyé contient également ce fameux site de restriction. Je me retrouve du coup avec 3 bandes au lieu de 2 sur mon gel après digestion.  [...] Une autre solution vient de me traverser l'esprit. faites une mutagénèse du site de restriction qui vous embête pour le flinguer.  [...]

PCR problème de poids moléculaire

Alors voilà j'ai reçu un plasmide d'un collaborateur contenant une séquence qui m'intéresse. Je dois récupérer cette séquence pour la sous-cloner dans un autre vecteur. J'ai donc designé 2 primers contenant le début ou la fin de ma séquence + un site de restriction enzymatique.  [...] alors ce ne sont pas des problèmes de migration ou d'agarose j'ai vérifié... J'ai pensé à la complémentarité mais quand je séquence le plasmide de départ avec les primers utilisés pour ma PCR je retrouve la séquence attendue, ce qui veut dire qu'ils s'hybrident au bon endroit.  [...]

Manipulations génétiques

Pour intégrer un gène d'intéret dans un génome, c'est assez compliqué, je me ferai un plaisir de t'expliquer si tu connais les notions de PCR, séquences nucléotidiques complémentaires, arn polymérase, plasmide, vecteur, recombinaison homologue ^^.  [...] Ensuite tu peux insérer ton gène dans un plasmide vecteur (procédé encore compliqué, avec des notions de multi site de clonage etc etc ^^).  [...]

[Biologie Moléculaire] ARN antisens à partir d'un fragment de gène

Par recherche dans les banques de données sur internet vous avez trouvé la séquence du gène de l'hormone de croissance humaine. A quel endroit du gène choisiriez-vous la séquence de votre sonde d'ADN pour cribler la banque que vous venez de construire et trouver l'ADN complémentaire codant pour l'hormone de croissance.   [...] Un plasmide vecteur de clonage créé artificiellement peut avoir autour de son MCS (Multiple Cloning Site) deux promoteurs différents (phages T7 et SP6), ce qui peut donner lieu à deux ARN (un sens et un antisens), selon que le démarrage de la transcription se fasse à un promoteur ou à l'autre.  [...]

[Biochimie] Méthode Cre-Lox : application ?

On insère les sites LoxP de part et d'autre du gène d'intérêt par recombinaison homologue. C'est à dire qu'on prend la séquence des parties flanquants le gène, pour chacune d'elles, on y ajoute le site LoxP. Chaque séquence modifiée (une par partie flanquante) est intégrée dans un vecteur (plasmide ou virus).  [...] Les cellules sont transfectées (plasmide) ou transduites (virus). Une fois l'ADN exogène dans le noyau, les parties homologues vont s'intégrer au niveau d'un des deux brins d'ADN du gène d'intérêt par recombinaison homologue (voir les protéines BRCA2, Rad50, Rad51 pour la compréhension de ce processus chez l'Eucaryote supérieur) car elle correspondent précisément aux séquences des parties flanquantes.  [...]

[Biologie Moléculaire] difficulté plasmide lentiviral

J'ai un problème de clonage d'un petit oligo (shRNA) dans un vecteur lentiviral qu'il faut digérer AgeI/EcoRI pour le site de clonage. Sauf que mon problème se révèle bien plus basique que cela, après quelques déboires, je viens de me rendre compte que je n'arrive même pas à obtenir des clones après transfo de mon plasmide simplement digéré EcoRI OU AgeI et religué sur lui-même.  [...] .. Le plasmide non digéré se transforme sans problème même si après une nuit à 37°C les clones sont assez petits. Pour info, il est conseillé d'utiliser des bactéries déficientes pour la recombinaison avec ce plasmide, donc j'ai utilisé des SURE2. Je précise aussi qu'après avoir constaté que j'avais un problème basique dans ma ligation, je l'ai refaite avec nouvelle ligase et nouveau tampon de ligase et.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide

Je dispose de deux enzymes de restrictions, une XhoI qui possède deux site de restriction dans la cassette de polyclonage. l'autre enzyme est MluI cependant sur le schema du plasmide je n'ai pas son site de restriction donc je ne sais pas ou elle coupe.  [...] oui tu peux, sous certaines conditions. Il faut un site de restriction dans le vecteur, et un autre dans l'insert (pas au milieu de l'insert). Selon que l'insert est dans un sens ou dans l'autre, tu auras deux fragments différents en taille. Pour l'histoire du plasmide natif j'aurais dit que c'etait le vecteur seul.  [...]

[Biologie moléculaire] Linéarisation de vecteur PGEMt pour faire des sondes HIS

J'ai une petite question concernant le vecteur PGEMt. Ce vecteur comprend un site multiple de clonage (avec mon insert d'intérêt) ainsi que des sites d'initiation de la transcription T7 et SP6. Je me demandais s'il était nécessaire de linéariser le plasmide avant de faire agir les polymérases SP6 et T7 ou bien s'il est prévu dans le plasmide des sites d'arrêt de transcription.  [...] Je sais qu'il existe des sites de terminaison de la transcription (paires de GC, structures secondaires, signal de polyadénylation.. en fonction de si on se place chez des procaryotes ou des eucaryotes) mais j'ai beaucoup de mal à trouver l'information pour le vecteur PGEMt.  [...]