• Forum - Vecteur, Expression, Séquence

[Biologie Cellulaire] Vecteur d'expression transitoire

Mais comment va se faire l'expression en fait Des facteurs de transcription vont reconnaître le promoteur et l'activer, entrainant l'arrivée de l'ARN polymérase (comme un gène normal).  [...] Dans le cas du promoteur fort CMV, je ne pense pas que ce soit des facteurs de transcription spécifique qui se fixe à sa séquence mais tout simplement les facteurs généraux de transcription. C'est juste que la force du promoteur est bonne. le complexe de transcription est rapidement associé au promoteur et positionné, et l'étape d'initiation se fait elle aussi rapidement, ce qui permet à la RNA polymérase II de rapidement libérer le promoteur pour qu'une autre RNA polymérase II vienne se positionner à son tour.  [...]

[Biologie Cellulaire] Séquence nucléotidique des protéines.

On raboute suggère plutôt que l'on est en train de parler de clonage. Il s'agirait donc de l'ADNc que l'on insert dans un vecteur (vecteur d'expression) en phase avec la séquence codante pour une enzyme (betagalactosidase, lucide case, chloramphénicol acétyle transférase, etc).  [...] L'idée peut être ici de suivre l'expression protéique de la protéine d'intérêt en suivant l'activité de l'enzyme rapportrice.  [...]

[Biologie Moléculaire] shRNA

Peux-tu nous donner un peu plus d'indications de ce que tu veux faire et sur quel point tu as besoin d'aide pour ton design Tu veux cloner ta séquence shRNA dans un vecteur d'expression.  [...] Pour faire un shRNA tu construis ton oligoN°1 en mettant. site restriction-séquence siRNA-TTCAAGAGA(boucle)-séquence siRNA à l'envers -site restriction (je te renvoie à l'article suivant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Détection d'une protéine

Sinon pas le choix, faut refaire le clonage. S' il y a encore des sites de restrictions uniques en 3', il est possible d'y cloner une séquence composée de 2 longs oligos hybridés codant pour une étiquette, mais ca ne me semble pas beaucoup plus simple que de recommencer malheureusement.  [...] Pour ma part, je me demande si je n'ai pas que des mauvais oligos parce que j'ai refait 5 fois mon clonage (digestion plasmide, insert, PCR...) et quand je séquence je retrouve tout le temps le même problème. il me manque au moins 20 nucléotides et y en a 4 qui sont apparus (TTGG je crois).  [...]

Clonage par PCR

J'ai une petite question... j'aimerais savoir a quoi correspond exactement l'expression clonage par PCR. Est-ce quand on ajoute en 5' de l'amorce la sequence specifique d'un site de restriction, ce qui permet ensuite de liger le produit de pcr dans un vecteur contenant le meme site de restriction (en resume) Ou bien est-ce autre chose.  [...] Je pense qu'il s'agit tout simplement d'un clonage à partir d'ADN que tu as amplifié par PCR q'il s'agisse d'une ligation après digestion enzymatique ou autre.   [...]

[Biologie Moléculaire] pCMX vecteur

Je viens de recevoir le vecteur d'expression pCMX mais l'expéditeur ne possédait pas la séquence ainsi que la carte. J'ai regardé sur le net mais impossible de trouver les caractéristiques de ce plasmide. J'aimerai savoir si quelqu'un possède ces informations ou sait où je peux les trouver.  [...] C'est le problème de la sous-traitance. Certains sous-traite leur travail (le clonage en particulier) et ne demandent pas les caractéristiques du plasmide du moment ou ils possèdent leur gène d'intéret dans un vecteur d'expression.  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr/clonage

Il faut donc un promoteur en amont du fragment pour qu'il soit transcrit, il faut des séquences d'initiation de la transcription pour l'expression chez une bactérie, une séquence ori qui permet la réplication du vecteur et de son insert. Tout ceci se trouve dans un vecteur et est indispensable à l'utilisation du fragment isolé.  [...] D'où la nécessite de s'embêter à insérer le fragment dans un vecteur.  [...]

[Biotechnologie] vecteur de clonage et vecteur d'expression

Un vecteur d'expression possède, en plus, des séquences permettant l'expression de l'ADN de l'insert.  [...] * promoteur (eucaryotes ou procaryotes selon ce qui est recherché), séquences d'initiation de la transcription au sens large, terminaison de la transcription,  [...]

[Biologie Moléculaire] le clonage impossible, ou comment se prendre la tete...

J'ai exactement le même problème que toi, également pour un clonage très simple. je veux extraire la séquence codante (750 pb) de mon vecteur d'expression pUSE-Amp (5.5 kb) puis religuer le vecteur vide afin d'avoir un contrôle négatif pour mes transfections.  [...] J'ai également tenté d'insérer ma séquence codante dans un autre plasmide d'expression. là je digère mes deux plasmides (le vecteur vide et mon plasmide parental ) avec EcoRI et XbaI et j'ai testé les rapports 1.3 et 1.9. Lorsque je fais migrer mes produits de ligation, je ne vois plus mon vecteur vide mais des bandes qui pourraient correspondre à mon plasmide avec insert surenroulé et non surenroulé, ainsi que des concaténaires d'insert. Et là encore, je n'ai pas de colonie.  [...]

[Biotechnologie] Expression d'une protéine

La séquence du gène comporte en 5' un site BamH1, et c'est le seul site du gène. Je voudrais insérer ce gène dans le vecteur d'expression mais je dois créer des sites de restriction en amont et aval du gène et je ne sais pas comment faire. En fait, si j'isole mon gène depuis la bactérie, je me retrouve avec 617 pb, comment puis-je ajouter des nucléotide amont et aval pour créer des sites de restriction (mutation par PCR) sur ces sites.  [...] Mon problème étant surtout que je pensais seulement avoir la séquence à partir de l'AUG, mais j'ai bien l'ensemble du gène. je change seulement quelques bases au début pour créer un site.  [...]