• Forum - Température, Hybridation, Séquence

[Biologie Moléculaire] Clonage

Ta température d'hybridation est faible, quel est le Tm de tes amorces Peux tu nous donner la séquence de tes amorces pour les checker.  [...] A une température aussi basse d'hybridation, la stringence étant moins forte il peut y avoir une formation de structures secondaires empêchant la PCR, sur les amorces ou sur la matrice. Essayes une température plus haute comme le recommande YouLab, à 60°C, cela peut résoudre ton problème.  [...]

[Biologie Moléculaire] Faire des Amorces PCR sans logiciel

la séquence donnée est celle du brin sens = codant = non transcrit. L'oligo F doit s'hybrider avec l'autre brin, il doit donc avoir la même séquence que le brin sens. L'oligo R doit s'hybrider avec le brin sens, il doit avoir une séquence correspondant au brin antisens (3'.  [...] Par contre, il faut faire attention au Tm qui sera séquence spécifique (augmente proportionnellement avec le nombre de G/C). Un Tm de 55 à 60°C est le plus courant. Il faut que F et R aient des Tm proches et faire une PCR avec une température d'hybridation 1°C sous ce Tm.  [...]

séquences d'un couple d'amorces pour pcr

Theoriquement tu selectionnes des regions de tailles comprises entre 18 et 25 nt qui ont une temperature d'hybridation. a 60°C idealement et dont le % en GC est aux alentours de 50% (conditions ideales). Ensuite faut s'assurer que ta sequence ne fait pas de structures secondaires, ne s'apparie pas ailleurs et ne forme pas de duplex avec ton deuxieme oligo.  [...] Enfin il est preferable que l'exremité 3' de l'oligo (la ou commencera la reaction de polymerisation par la Taq) soit un G ou un C. pour l'extremité 5' on se moque de savoir ce qu'il y a. a l'extreme limite tu peux meme rajouter (en plus des 22nt de ton amorce) 50nt qui ne s'apparient pas du tout a ta sequence et qui seront donc insérés dans ton produit de PCR final.  [...]

[Biochimie] PCR / sanger / amorces / séquences /

la tempérture d'annealing (d'hybridation de ton amorce sur son complementaire au niveau du brin) doit se trouver entre 55 et 68 approximativement (le calcul simplifié de la température est quelque chose du genre. le nombre de A + T multiplié par 2, + le nombre de C + G multiplié par 4, et ca te donne ta temperature pour le Ta qu'on appelle Tm), le nucleotide en dernière position est important aussi, il ne faut pas que ca soit n'importe lequel, et il est preferable de ne pas avoir plusieurs (genre 4 ou 5 ou plus) G a la suite vers la fin de ton primer sinon ca mène a des structure secondaire et ton primer ne sera pas linéaire et s'hybridera mal.  [...] La température d'hybridation est rarement de 50, tu dois choisir la température qui correspond a ta séquence (voir message #2) et pour l'élongation c'est souvent 72, mais la encore je crois que ca peut dépendre de la température optimale de l'activité de la polymérase.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagenèse par PCR : Tm des oligos

Nous devons mettre en relation les températures choisis avec le Tm des oligos mais je ne comprend pas pourquoi nous avons régler l'hybridation sur 55°C alors que les oligos ont un Tm de 79°C... Est ce que quelqu'un pourrait m'aider.  [...] Je crois que j'ai compris. on diminue la température d'hybridation car la séquence de l'oligo n'est pas 100% appariée et donc si on veut qu'elle s'apparie il faut lui laisser du temps.  [...]

[Biotechnologie] Temperature d'hybridation pour southern Blot

Je suis entrain de rechercher un gene d'interet par southern Blot. J'utilise comme tampon d'hybridation, le Easy Hyb de ROCHE. J'ai utilise 65 degre comme temperature d'hybridation et apres les differents lavages (utilisant 65 degre de temperature de lavage, quand il le faut pour rester dans la stringeance) de ma membrane jai obtenu de tres beaux signaux.  [...] Mais le hic, cest que on me dit que avec ce tampon d'hybridation, la temperature a utiliser est au maxi 50 degre. Alors du coup sais pas si mes signaux obtenus sont specifiques ou si ma sonde a pris un coup apres hybridation dans une temperature si elevee.  [...]

[Biochimie] Hybridation dans southern blot

salut, A mon avis il veut dire ce qui renforce le faite que chaque nucléotide soit correspondant à la séquence à hybrider. Pour cela on utilise des conditions d'haute stringence qui sont réalisés au moment de l'hybridation à la témpérature la plus élevée.  [...] Quand tu as fini de faire monter la témpérature à 100 degrés quand l'adn va être séparer au moment de revenir à température normal, tu incorpores ta soude à une témpérature très elevée par rapport à ce que cela aurait du être. Tu as donc forcement plus de chance que l'hybridation soit très précise ( à utiliser dans des cas d'analyses d'emprintes génétique précise).  [...]

Température d'hybridation et PCR

J'ai déterminer un Tm de 52°c avec les amorces mais dans l'article ils utilisent une température d'hybridation de 54°. est-ce parce que en dessous de 54° l'hybridation n'est plus assez spécifique.  [...] Oui mais il faut bien que l'ADN soit suffisamment dénaturer sinon l'hybridation n'est pas possible sur de l'ADN bicaténaire. Et c'est bien pour cela qu'on prend comme référence le Tm qui en fait est une température de demi-dénaturation.  [...]

températures et PCR

La température d'hybridation c'est celle qui permet que les amorces se fixent à la matrice si je comprends bien et le Tm c'est la température a laquelle il y a 50% de simple brin mais je n'arrive pas a faire le lien avec les amorces parce que ça c'est la dénaturation non.  [...] Pour que tes amorces puissent s'hybrider à la matrice d'ADN, il faut que celle-ci sois dénaturée pour permettre l'accessibilité des amorces. Ainsi à Tm-5°C on considère que l'hybridation peut se faire correctement. Et oui, le Tm est la température à laquelle tu as 50% de ton ADN sous forme simple brin (et donc 50% en double brin).  [...]

[Biologie Moléculaire] Temps d'hybridation des amorces

..). C'est pour cela que la température d'hybridation est généralement plus faible de 5-10°C de la température de fusion, nécessaire pour séparer les deux brins. Je rappelle également que la température de fusion est dépendante de la longueur de l'ADN, mais également de son pourcentage en GC (et d'autres paramètres plus complexes).  [...] petites précisions. la température dépend de la longueur mais jusqu'a un certain point seulement. En PCRq, les temps d'hybridation sont généralement de quelques secondes (5-10 secondes) pour des 19-22mers.  [...]