• Forum - Tampon, Migration, Transfert

Western Blot

C'est un peu désespérée que je viens vers vous aujourd'hui. Nous avons effectué un Western Blot en TP la semaine passée, les protocoles nous ont été distribués le matin même, je n'en avais jamais fais auparavant, c'est une technique qui prend un certains temps et donc tout a été fait à l'arrache, nous n'avons pratiquement pas eu d'explication.   [...] - quelle est la différence entre un tampon d'extraction et un tampon de chargement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot

Je voudrais savoir ce qu'il arriverait si on interverti le tampon de migration avec le tampon de transfert Donc ma question est. les tampons jouent-ils un role primordial dans le Western.  [...] NB. j'ecris avec un clavier qwerty aussi veuillez m'excuser pour l'absence d' accent.   [...]

[Biologie Moléculaire] Blot: pourquoi papier filtre ?

Ce n'est pas que le champ électrique sera moins fort c'est que l'air, de la bulle, ne conduit pas le courant contrairement au tampon de tranfert. le transfert ne se fera pas du tout là où il y a des bulles.  [...] dans le cas d'un transfert semi-sec, le papiers filtres sont imbibés du tampon de tranfert. Ils servent donc de reservoir a tampon pour permettre le passage du courant et donc la migration des echantillons.  [...]

[Divers] Contenu "Matériels et méthodes" - rapport stage M1

Les extraits protéiques sont dénaturés à 95°C pendant 5 minutes en présence de LSB 1X final avant d'être déposés sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 6%. Les immunoprécipitations sont dénaturées à 95°C pendant 5 minutes dans 25 µl de LSB 2,5X. Après migration électrophorétique, les protéines sont transférées en milieu liquide sur une membrane de nitrocellulose (HybondTM C Extra, Amersham Bioscience) pendant 1h30 dans un tampon de transfert (50 mM Tris base, 40 mM Glycine, 1,3 mM SDS et 10% éthanol).  [...] Après transfert, la membrane est bloquée dans une solution de lait 5% TBS-Tween 0,2% pendant 1 heure à température ambiante sous agitation. Elle est ensuite incubée avec les anticorps primaires anti-BRCA1 monoclonal (D9) dilué au 1/500 (Sigma®), anti-HSP60 monoclonal (CK) au 1/1000 (Sigma®) pendant une nuit à 4°C sur une plaque rotative.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot flou

C'est bizzare. Quand je fais un petit gel à 10 %, il migre à 100 V 2 H maxi. Le problème vient peut-être du tampon trop faible en ions (vérifie les concentrations ainsi que les réactifs stocks) et peut-être aussi de ta cuve. Si les bandes sont floues c'est plus un problème de migration que de transfert je pense.  [...] de toute manière dés lundi j'ai prévu de refaire toutes les solutions on ne sait jamais. ce sont des solutions stocks préparéés à chaque fois par un membre du labo donc on ne sait jamais surtout qu'on vient de me signaler un doute sur le tampon de migration préparé par 2 personnes différentes (donc y a déjà un doute).  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Avant de s'attaquer au transfert, êtes-vous sûr, dans un premier temps, que les protéines de cette taille rentrent dans le gel dans vos conditions de migration.  [...] C'est ce qu'on veut d'ailleurs montrer en traitant les cellules différemment). J'ai alors acheté des gels commerciaux de chez BioRad ( 10%). J'ai suivi leur protocole de migration (200V pendant 45 min), j'ai fais le semi dry transfert à 25V pendant 2h. Le transfert a été parfait car mon marqueur de poids moléculaire de 300kda a été bien transféré.  [...]

Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

La sérine aurait une possibilité d'intéragir au niveau structurel avec un autre aa de ta séquence malgrè la présence de dénaturant Même si au moment de l'injecté elle est dénaturé, le fait que le tampon de migration dilue le composée dénaturant et imaginant que ta protéine a une vitesse de reconformation 3D rapide, alors il est possible que.  [...] Il ne devrait pas y avoir de renaturation de la protéine durant la migration puisque normalement noirdez a coulé des gels contenant du SDS pour migrer en condition dénaturante, et le tampon de migration contient une quantité élevée de SDS. La seule renaturation qui peut avoir lieu est, a priori, durant le transfert car on dissocie le SDS de la protéine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Electrophorèse (ADN sur Agarose) et Bromure d'éthidium

Si vous avez perdu du signal en laissant trop migrer votre ADN et que vous n'avez pas mis de BEt dans le tampon de migration, vous pouvez également récupérer ce gel et le mettre dans un bain de tampon de migration + BEt + agitation. Il faut incuber pendant un bon moment quand même, donc s'il vous reste de l'échantillon ça peut être plus rapide de refaire un gel et d'en redéposer (en laissant moins migrer cette fois ou en mettant du BEt dans le tampon cette fois ).  [...] Personnellement, je n'ai jamais entendu quelqu'un mettre du BET dans le tampon de migration, je n'ai jamais vu non plus de la perte de signal (en tout cas, visible) lorsque le BET est ajouté lors de la préparation du gel.  [...]

Immunoblot

Entre la migration sur gel et l'autoradiographie tu as en plus une étape d'électro-transfert qui comme son nom l'indique permet simplement de transférer les protéines du gel vers une membrane (que tu vas ensuite utiliser pour faire l'autoradiographie), encore une fois grace à un champ électrique (car le sprotéine sont toujours chargées négativement).  [...] Le western blot consiste en une migration des protéines dénaturées au beta mercaptoethanol et SDS dans un gel de polyacrylamide+SDS (détergent qui va dénaturer les protéines et les charger), un transfert sur membrane et une révélation grâce à des anticorps marqués.  [...]

[Biochimie] Chromatographie d'exclusion

Conseil. le gel c'est des petit billes, elle coulent mais au moindre mouvement de l'eau elles bougerons. Donc pour éviter ça au maximum pendant la migration (après le dépos) met 3 ou 4 cm de tampon en réserve au dessus du gel. Comme ça quand tu en rajoutera ça brassera moins le gel que si le niveau de tampon est a raz (tu me suis).  [...] Pour résumer tu ouvre le robinet pour faire descendre le niveau du tampon a raz le gel quand tu va faire ton dépôt et quand tu fait ta migration.  [...]