• Forum - Tampon, Coupe, Glycérol

Carte de restriction d'un plasmide inconnu

Sachant que l'on doit choisir 5 à 6 enzymes. Deja dans un premier temps comment peut on savoir lesquels choisir préférentiellement Est ce que le choix des enzymes auraient juste avoir avec les couples d'enzymes qui ont une bonne activité ensemble pour pouvoir les coupler lors des digestion avec un même tampon Je compte faire mes digestions et analyser sur gel d'électrophorèse d'agarose à 1% (ne connaissant pas du tout la taille du plasmide je suppose qu'il a plus de chance de se trouver entre 10kb et 0.  [...] Le deuxième problème est la concentration en glycerol. Généralement, les enzymes sont suspendu dans un tampon coupé à 50% de glycerol, afin d'éviter les cycles de congélation/décongélation, qui abimeraient l'enzyme. Cependant, le glycerol est très mauvais pour l'activité de l'enzyme, et communément, ont admet que la quantité d'enzyme (+glycérol) ne dois pas dépasser 10% du volume total de digestion.  [...]

[Biochimie] migration sds page

Pour ce qui est du tampon de charge, j'utilise le glycérol dans un pourcentage normal correspondant à d'autres protocole. Je vais essayer d'en faire moins concentré en glycérol car cette hypothèse me semble possible.  [...] Je pense que c'est surtout un défaut de migration. En utilisant un b-mercapto neuf pour mon tampon de charge j'ai eu hier une migration nettement plus efficace. Je pense que le problème c'est surtout la quantité de glycérol dans le tampon (merci Vinc) et le fait que les lot de b-mercapto que j'avais utilisés était plus très bon.  [...]

[Biochimie] tris-HCL

Bonjour, votre discussion m'intéresse tout particulièrement. Lorsque je purifie une protéine, il est donc conseillé de la placer en tampon TGED. Mais pour certaines manips, lors de l'étude de la protéine, le glycérol va gêner. Il faudrait donc une étape supplémentaire d'ultrafilatration/dialyse pour éliminer le glycérol comemnt procédez-vosu d'ordinaire.  [...] Generalement je concentre ma proteine et change le tampon directement apres elution par centrifugation sur colonne (microcon ou autre). Je m'arrange aussi pour concentrer ma proteine au minimum 100x. Comme ca quand j'ai au max 0.5% de glycerol final.  [...]

[Génétique] Electrophorèse-ADN

Sinon en plus du bleu de dépôt, il y a du glycérol dans votre solution afin de faire tomber l'ADN au fond de chaque puits et pour qu'il puisse migrer grâce au tampon de migration moins dense.  [...] En fait, la réponse est. rien. Classiquement le tampon de charge pour les acides nucléiques ne contient rien d'autre que des indicateurs colorés et du glycérol.  [...]

[Biochimie] Sds page

Tu peux filtrer, mais ce n'est pas nécessaire (le SDS va tuer toute les petites bêtes). Le Tris a un pouvoir tampon fort, surtout à forte concentration, mais la glycine a aussiun pouvoir tampon (plus faible, certe). Si la concentration du tampon Tris que tu utilises dans ce gel est plus faible, cela peut induire des variations de pH (mais n'a pas d'impact sur la polymérisation normalement).  [...] Pour le tampon de charge, il est plus stable sur de longue période à -20. Pas besoin de filtrer (de toute façon, avec du glycérol dedans, cela ne va pas être facile), et normalement, tu le fais chauffer avec les protéines juste avant le dépôt. Et dans tout les cas, ce composants n'a aucun rôle dans la polymérisation du gel.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de Taq polymérase.

Je dirais tu auras peut être plus d'amplicons si tu n'as pas optimisé cet aspect de ton mix PCR, à part ça... Normalement la TAQ n'agit qu'après être fixé sur un double brin d'ADN donc la compétition je vois pas trop. Tu veux dire plusieurs Taq essayant de se fixer aux mêmes sites.   [...] peut etre aussi un tampon de conservation de la taq qui se retrouve trop concentré (glycérol, azide,...).  [...]

[Biochimie] Pb échantillon gel Tris-Tricine

Je travaille sur un peptide inférieur à 3 KDa et je voulais le visualiser en western blot. Mais je rencontre un petit problème. lors de la migration en gel tris-tricine, mes échantillons se reserrent )( dans mon gel de séparation. Pb de sels Mes échantillons sont préparés avec des cellules fraîches et broyées directement dans le tampon d'échantillon.  [...] On a utilisé un gel Tricine à 16,5% pour les peptides entre 1,5 et 25KDa. Le tampon d'échantillon est spécifique de ce type de gel (0,1M Tris-HCl, 2% ßMEE,20% glycérol, SDS 1%, 0,02% coomassie G250)ce n'est pas du laemmli (pour gel tris-glycine)mais oui on sonique directement dans le tampon.  [...]

[Biochimie] Tampon de purification, NaCl et KCl

Je fais une purification par chromatographie d'affinité d'une protéine, qui était jusqu'à présent dans un tampon Tris + NaCl 0,4 M, du glycerol, et de l'imidazole.  [...] Ma question est donc. pourquoi la concentration de KCl dans un tampon est toujours plus faible que le NaCl Le KCl stabiliserait la protéine plus efficacement, et éviterait les interactions non spécifiques à concentration plus basse.  [...]

Précipitation protéines au sulfate d'ammonium

- Mes solutions stocks de sulfate de protamine et de sulfate d'ammonium doivent elles être préparées dans de l'eau ou dans mon tampon d'extraction (important, il contient 20% de glycérol qui doit largement modifié la solubilité des deux sels précédents) J'ai tenté de préparé le sulfate de protamine dans le tampon et j'ai de gros problèmes de solubilité.  [...] Je me dis qu'il faut certainement le préparer dans l'eau mais du coup, je fais diluer le tampon d'extraction de ma protéine. Dans la publication, les auteurs ne spécifient rien. Pourriez vous m'éclairer svp.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

...Seulement là j'ai un petit soucis parce que dans mon contrôle (plasmide whitescript) et dans mon echantillon, tout ce que je dépose sur mon gel reste dans le puit...(je dépose 5µl de produit de PCR).   [...] Oui je dépose un marqueur de taille qui migre normalement et comme tampon de charge j'utilise du bleu de bromophenol (avec glycerol et EDTA).  [...]