• Forum - Sonde, Hybridation, Température

[Biologie Moléculaire] In situ

Est-ce quelqu'un peut m'aider, je fais de l'insitu hybridations (Anti-DIG) sur des lames mais cela ne fonctionne pas, est ce que quelqu'un aurais une protocole pour l'Insitu ou qu'est ce que je dois faire pour avoir une hybridations.  [...] J'ai seulement du non spécifique et des petites points qui sont partout de façons aléatoire, j'en ai fait aussi avec l'anticorps anti-DIG alkaline phosphatase et j'avais encore le non spécifique. Je n'ai pas encore essayer de faire avec une nouvelle sonde merci pour votre aide je vais aussi changer la température de mes lavages, mais est-ce que vous pensez que je dois refaire aussi les solutions pour l'hybridation et le lavage.  [...]

Probleme PCR en temps réel

parce que votre amplification est très faible, parce que votre PCR ne fonctionne pas bien. Et là il y en a des possibilités. programme (durée, température), échantillons (qualité, quantité), amorces... Il faudra en dire plus.  [...] oui, c'est du taqman, et les amplicons correspondent bien à la taille attendue. Effectivement, la sonde est récente. Je voudrai rajouter que le Tm des amorces est 56.2°C pour le sens, 56.9°C pour l'antisens et 67.9°C pour la sonde et j'ai pris 60°C pour la température d'hybridation.  [...]

[Biotechnologie] Temperature d'hybridation pour southern Blot

Je suis entrain de rechercher un gene d'interet par southern Blot. J'utilise comme tampon d'hybridation, le Easy Hyb de ROCHE. J'ai utilise 65 degre comme temperature d'hybridation et apres les differents lavages (utilisant 65 degre de temperature de lavage, quand il le faut pour rester dans la stringeance) de ma membrane jai obtenu de tres beaux signaux.  [...] Mais le hic, cest que on me dit que avec ce tampon d'hybridation, la temperature a utiliser est au maxi 50 degre. Alors du coup sais pas si mes signaux obtenus sont specifiques ou si ma sonde a pris un coup apres hybridation dans une temperature si elevee.  [...]

[Biologie Moléculaire] primer dimer

La formation de dimères est due à des conditions de PCR trop permissives, après évidemment un design d'amorces non optimum. Les paramètres que l'on peut modifier sur un qPCR pour diminuer les dimères sont la température d'hybridation (la diminuer), puis la concentration en MgCl2 (la diminuer), et évaluer le ratio sonde/amorces en concentration.  [...] Si tous ces essais ne changent rien et que la présence de dimère reste dommageable pour la PCR (car un dimère en Sybr Green, ça se voit souvent, mais en TaqMan, beaucoup moins) avec une éventuelle inhibition ou limitation de la réaction de PCR par la réaction parasite, alors il faudra repenser le système d'amorces et repartir sur un nouveau design.   [...]

[Biologie Moléculaire] PCR en temps réel

Quelle méthode suis-tu pour choisir tes amorces A la main ou avec des logiciels qui prédisent les structures secondaires et les sites d'hybridations potentiels.  [...] euh, je pense que tu fais une petite erreur Annaick sur la stringence de la PCR par l'augmentation du MgCl2. Si tu augmentes sa concentration, la PCR deviendra plus permissive aux réactions non spécifiques. Si tu veux augmenter la stringence de ta PCR pour diminuer les Dimères, il faut tester la diminution de la concentration en MgCl2, augementer la température d'hybridation de ta PCR, ajouter une sonde TaqMan et lui donner la concentration la plus faible possible pour ton système.  [...]

[Biochimie] Hybridation dans southern blot

salut, A mon avis il veut dire ce qui renforce le faite que chaque nucléotide soit correspondant à la séquence à hybrider. Pour cela on utilise des conditions d'haute stringence qui sont réalisés au moment de l'hybridation à la témpérature la plus élevée.  [...] Ta sonde est de plus en plus spécifique si elle est de grande taille. mais n'oublie pas qu'une hybridation (= fixation cible/sonde) dépend aussi de la température. Selon la température, tu peux fixer une sonde sur une région qui ne lui correspond pas du tout. tu obtiens alors des faux positifs.  [...]

[Biologie Moléculaire] hybridation in situ

je veux réaliser une hybridation in situ en utilisant des sondes marquées par cy3 et FAM sur des cellules d'amibes, je veux savoir est ce que la température (Tm) intervient dans la réaction d'hybridation.  [...] et en général il faut placer la température d'hybridation un peu en dessous du Tm des sondes pour s'assurer une bonne hybridation, mais pas trop en dessous pour éviter l'hybridation non spécifique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Hybridation ADNc / ADNg : besoin de confirmer !

Jusque là tout vas bien. sur notre ADNg. on a bien deux sites de restrictions adjacents HindIII qui donnent un fragment de 0,3Kb et qui hybrident avec ma sonde H.  [...] D'après moi, cette expérience confirme mon hypothèse de présence d'un intron de 0,8Kb sur le fragment d'ADNg de 1,8Kb NcoI/NcoI. En effet, si on obtient deux bandes radioactives, c'est que notre fragment de 1,8Kb est coupé en deux par l'enzyme HindIII & la sonde N hybride avec ces deux fragments.  [...]

températures et PCR

Plus il y a de GC et plus la température d'hybridation est élevée mais pourquoi Il faut une forte température pour créer les liaisons.  [...] La température d'hybridation c'est celle qui permet que les amorces se fixent à la matrice si je comprends bien et le Tm c'est la température a laquelle il y a 50% de simple brin mais je n'arrive pas a faire le lien avec les amorces parce que ça c'est la dénaturation non.  [...]

[Biologie Moléculaire] Temps d'hybridation des amorces

..). C'est pour cela que la température d'hybridation est généralement plus faible de 5-10°C de la température de fusion, nécessaire pour séparer les deux brins. Je rappelle également que la température de fusion est dépendante de la longueur de l'ADN, mais également de son pourcentage en GC (et d'autres paramètres plus complexes).  [...] petites précisions. la température dépend de la longueur mais jusqu'a un certain point seulement. En PCRq, les temps d'hybridation sont généralement de quelques secondes (5-10 secondes) pour des 19-22mers.  [...]